[发明专利]仿细胞结构纳米材料及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了仿细胞结构纳米材料及其制备方法和应用，所述方法先对介孔纳米材料进行表面离子改性，形成亲水性的表面修饰；再对目标细胞先后进行裂解、不连续蔗糖‑壳聚糖密度梯度提取等纯化处理获得目标膜蛋白，然后在超声引导下通过静电吸附原理将目标膜蛋白快速组装到介孔纳米颗粒表面上，形成由目标膜蛋白、空腔和纳米材料壁组成的仿细胞纳米结构。本发明克服了现有提取细胞膜靶向膜蛋白的随机不确定性和低纯度性，完整保留原有膜蛋白的生物活性，提高仿细胞结构纳米材料的制备效率。本发明可应用于各种细胞的膜蛋白的分离与纯化，抗肿瘤、抗病毒、抗细菌等药物递送载体，预防性和治疗性的纳米疫苗药物、或诊疗一体化纳米材料等生物医学领域。

技术领域

本发明属于纳米技术领域，涉及生物医学应用领域的纳米材料，具体为仿细胞结构纳米材料及其制备方法和应用。

背景技术

在肿瘤的发生和发展过程中，肿瘤细胞表面呈递的抗原使免疫系统能够识别并打击肿瘤细胞；但另一方面，它们也介导了肿瘤细胞的同源结合现象以及免疫逃避。如癌症患者血中半乳糖凝集素-3水平明显增高，其与癌症相关的跨膜黏蛋白MUC1相互作用，提高了循环肿瘤细胞的同源聚集现象，减少失巢凋亡，促进肿瘤转移。有研究表明，用细胞膜表面抗原修饰的人工合成纳米材料可以增加肿瘤疫苗的效果。除此之外，目前已有研究成功地将红细胞、白细胞等细胞膜用于包被功能性纳米材料(如金纳米粒、硅纳米粒等)，这些膜包被的纳米材料可表现出目标细胞特异性的靶向结合。除此之外，还达到激活免疫系统、提高抗肿瘤免疫反应、延长在循环中的停留时间、药物有效呈递等目的。但目前存在的提取膜蛋白和膜蛋白包被纳米材料的技术存在步骤繁琐、提取出来的膜纯度不高、且容易造成蛋白变性等问题。

中国专利申请CN201711360290.0公开了基于巨噬细胞膜包被的乳腺癌靶向纳米粒及其制备方法，其实现巨噬细胞膜提取及包被乳腺癌靶向纳米粒的方法为：通过小鼠培养巨噬细胞，然后将巨噬细胞在液氮中反复冻融3-5次、清洗、离心、提取细胞膜；然后将细胞膜与纳米粒混合，通过配备有400nm、200nm或100nm滤膜的高压纳米挤出机反复推挤10-50次，从而制得巨噬细胞包被的装载紫杉醇的纳米粒制剂。采用以上物理方法制备膜包被纳米粒子步骤繁琐，条件苛刻，得率不高，且反复地机械挤压易造成膜蛋白变形失活。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，本发明通过梯度离心法提取高纯度细胞膜并形成膜包被纳米材料解决现有技术中用于包被纳米材料的细胞膜种类局限，且细胞膜纯度低、包被率较差等问题，本发明提供了高纯度膜蛋白提取、膜包被纳米材料的仿细胞结构纳米材料及其制备方法和应用。

技术方案：高纯度膜蛋白提取并形成膜包被纳米粒子的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)培养目标细胞，细胞状态基本要求：细胞活力高于60％，细胞纯度大于80％，细胞数目在1-25×10⁷个/次，备用；(2)取步骤(1)备用的细胞室温下2000rmp离心、弃上清，沉淀采用细胞膜提取裂解液重悬、并在冰上匀浆处理，2000rmp离心、收集上清液，沉淀采用细胞膜提取裂解液重悬；

(3)重复步骤(2)中的离心和重悬步骤，直至没有完整细胞；

(4)混合步骤(2)和步骤(3)收集的上清液，采用蔗糖-壳聚糖密度梯度离心得到纯化的细胞膜；

(5)取步骤(4)离心后每层样本，分析样本中的蛋白成分，用生理盐水稀释膜富集区域，4℃、20000g离心0.5小时，低压冻干、称重、加PBS、4℃储存；

(6)对步骤(5)储存的细胞膜进行蛋白定量分析，其中膜脂质质量浓度与膜蛋白质量浓度之比为1:4-3:1时；取与膜脂质浓度相等的经过表面等离子共振技术进行亲水化修饰的介孔纳米材料或负载目标物质的多功能介孔纳米材料加入细胞膜溶液中，在超声和0-4℃条件下反应1-12小时，9000rpm离心去除未结合的细胞膜，制得仿细胞结构纳米材料。