[发明专利]基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗及其制备方法及其应用方法

权利要求书

1.基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗，其特征在于，为LmΔactA/plcB-KRAS菌株的菌液；所述LmΔactA/plcB-KRAS菌株是以减毒单增李斯特菌为载体，携带KRAS蛋白基因的基因重组菌；

所述减毒单增李斯特菌为单增李斯特菌完整敲除actA和plcB这两个毒力基因而得；

所述KRAS蛋白基因由KRAS蛋白氨基酸序列经过李斯特菌密码子优化后，在上游加入HindⅢ酶切位点，下游加入Xho Ⅰ酶切位点，通过合成获得的DNA序列，SEQ ID NO.1。

2.基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗，其特征在于，为LiΔactA/plcB-KRAS菌株的菌液；所述LiΔactA/plcB-KRAS菌株是以减毒绵羊李斯特菌为载体，携带KRAS蛋白基因的基因重组菌；

所述减毒绵羊李斯特菌为绵羊李斯特菌完整敲除actA和plcB这两个毒力基因而得；

所述KRAS蛋白基因由KRAS蛋白氨基酸序列经过李斯特菌密码子优化后，在上游加入HindⅢ酶切位点，下游加入Xho Ⅰ酶切位点，通过合成获得的DNA序列，SEQ ID NO.1。

3.基于重组减毒李斯特菌的KRAS高表达癌症疫苗的制备方法，其特征在于，制备重组减毒单增李斯特菌的步骤包括：

步骤一，合成KRAS基因片段；

查询KRAS(G12D，G12V突变)氨基酸序列，然后根据李斯特菌偏好密码子表进行密码子优化得到优化后的序列，再在其上游加入HindⅢ酶切位点(AAGCTT)，下游加入Xho Ⅰ酶切位点(CTCGAG)，将设计好的序列通过合成直接获得；

步骤二，构建打靶质粒；

用限制性内切酶HindⅢ和Xho Ⅰ双酶切步骤一获得的KRAS基因片段，同时用相同的限制性内切酶酶切质粒pCW203(专利CN103074361B)，经连接、转化等技术将KRAS基因片段插入pCW203 HindⅢ和Xho Ⅰ酶切位点，得到中间质粒pCW203-KRAS，如SEQ ID NO.2所示，通过PCR验证、提质粒验证、酶切验证证实中间质粒的成功构建。切下步骤中间质粒pCW203-KRAS的BamHI酶切位点与XhoI酶切位点之间的片段插入重组质粒pCW180的BamHI酶切位点与XhoI酶切位点之间，得到打靶质粒pCW180-KRAS；其中，所述重组质粒pCW180的基因序列为序列表中SEQ ID NO.3所示；

步骤三，制备感受态细胞LmΔactAplcB-lacZ；

培养LmΔactAplcB-lacZ，定期测定A₆₀₀，当A₆₀₀＝0.4时，加入盘尼西林G，使其终浓度为12.5μg/ml继续培养；当A₆₀₀＝0.7时，离心，洗涤，分装，保存，得到LmΔactA/plcB-lacZ感受态细胞；

步骤四，利用打靶质粒对感受态细胞LmΔactAplcB-lacZ进行电转化；

取打靶质粒电转至LmΔactA/plcB-lacZ感受态细胞中，用电转仪电转后用培养液培养；将转化液涂布于红霉素BHI琼脂平板，通过蓝白斑筛选出单个蓝色菌落，纯培养后进行质粒提取和PCR验证；

步骤五，将LmΔactAplcB-lacZ与打靶质粒同源重组杂交培养、筛选验证；

将携带打靶质粒的单增李斯特菌，在42℃和30℃连续传代培养，利用同源重组杂交原理和基因打靶技术，将打靶质粒携带的目的片段整合至李斯特菌中，利用蓝白斑及红霉素敏感性筛选出可疑菌株；然后进行PCR筛选和基因测序验证；选出LmΔactA/plcB-KRAS菌株，制备菌液，得到疫苗。