[发明专利]一种用于对虾的假型昆虫杆状病毒基因转移系统、病毒及构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种用于对虾的假型昆虫杆状病毒基因转移系统、病毒及构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明所述用于对虾的假型昆虫杆状病毒基因转移系统，包括Bac‑to‑Bac昆虫杆状病毒表达系统、对虾病毒囊膜蛋白基因表达质粒和昆虫包装细胞。本发明所述用于对虾的假型昆虫杆状病毒基因转移系统能够在对虾组织和细胞中稳定高效地转移与表达外源基因。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种用于对虾的假型昆虫杆状病毒基因转移系统、病毒及构建方法和应用，即一种嗜对虾的假型昆虫杆状病毒基因转移系统、嗜对虾的假型昆虫杆状病毒及构建方法和在对虾成体组织与对虾细胞(体外培养细胞)中的应用。

背景技术

Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统(Invitrogen产品)，已是一种很成熟的昆虫细胞基因转移技术。该系统由转移质粒、辅助质粒、杆状病毒Bacmid质粒以及感受态细胞DH10Bac组成，是基于大肠杆菌转座酶Tn7的转座原理，成功实现在大肠杆菌中快速将外源基因重组到杆状病毒Bacmid质粒中，并扩增重组杆状病毒的目的。其中，转移质粒(pFASTBac1)的特点：在其昆虫强启动子PPH(多角体蛋白基因启动子)及其之后的多克隆酶切位点的两翼各插入转座酶Tn7的左右识别位点Tn7L和Tn7R；杆状病毒质粒(Bacmid)的特点：插入了原核细胞低拷贝质粒复制子(mini-F)、卡那霉素抗性基因以及插入了转座酶识别位点attTn7的LacZ基因(不移码插入)；辅助质粒为转座酶表达质粒；宿主细胞DH10Bac是稳定转化有辅助质粒和杆状病毒质粒Bacmid的大肠杆菌感受态细胞。

该昆虫杆状病毒表达系统的技术流程为：首先将外源基因例如GUS(β-D-glucoronidase，β-D-葡萄糖苷酸酶)克隆到转移质粒pFastBac1的多克隆酶切位点，纯化出重组质粒pFastBac-GUS；然后将其转化到大肠杆菌感受态细胞DH10Bac，然后在辅助质粒所表达的转座酶的作用下，GUS基因被转座到Bacmid质粒中的attTn7位点；提取和纯化Bacmid-GUS重组质粒；将Bacmid-GUS重组质粒转染包装细胞sf9，包装与纯化Bacmid-GUS重组病毒；包装病毒感染靶细胞，从而实现外源基因在靶细胞中的转移与表达。

但已有研究表明，该昆虫杆状病毒表达系统不能有效侵染对虾细胞，表明其在对虾细胞中的亲嗜性极低，不能应用于对虾组织和细胞的基因转移研究。

目前，在对虾成体和体外培养细胞中尚缺乏一种高效的基因转移与表达技术，严重阻碍转基因对虾和对虾基因编辑研究的顺利开展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于对虾的假型昆虫杆状病毒基因转移系统、病毒及构建方法和应用。本发明所述用于对虾的假型昆虫杆状病毒基因转移系统能够在对虾组织和细胞中稳定高效地转移与表达外源基因。

本发明提供了一种用于对虾的假型昆虫杆状病毒基因转移系统，所述基因转移系统包括Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统、对虾病毒囊膜蛋白基因表达质粒和昆虫包装细胞。

优选的是，所述对虾病毒囊膜蛋白基因表达质粒包括对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白基因表达质粒。

优选的是，所述对虾病毒囊膜蛋白基因表达质粒中所述囊膜蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的是，所述对虾病毒囊膜蛋白基因表达质粒的构建用骨架载体包括pcDNA3.1。

本发明还提供了基于上述技术方案所述基因转移系统的用于对虾的假型昆虫杆状病毒的构建方法，包括以下步骤：

1)利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统构建得到含外源基因的昆虫杆状病毒重组质粒；

2)将步骤1)得到的昆虫杆状病毒重组质粒和对虾病毒囊膜蛋白基因表达质粒共转染昆虫包装细胞，得到用于对虾的假型昆虫杆状病毒。