[发明专利]一种用于体内基因表达蛋白系统的转染剂及其体外转染的方法

权利要求书

1.一种用于体内基因表达蛋白系统的转染剂，其特征在于：由具有待表达的蛋白基因序列质粒和壳聚糖多聚赖氨酸聚合物以体积比为1：3的比例混合组成。

2.用于如权利要求1所述的体内基因表达蛋白系统的转染剂的具有待表达的蛋白基因序列质粒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤一，构建基因载体；

步骤二，将待表达的蛋白基因序列插入到所述步骤一构建的基因载体中。

3.根据权利要求2具有待表达的蛋白基因序列质粒的制备方法，其特征在于：所述步骤一中，载体采用环状质粒载体为基础，以环状质粒中的CMV为启动子，含有Poly(A)。

4.根据权利要求3具有待表达的蛋白基因序列质粒的制备方法，其特征在于：所述步骤二中在所述步骤一构建的基因载体上所述CMV启动子与所述Poly(A)之间插入待表达的蛋白基因序列。

5.用于如权利要求1所述的体内基因表达蛋白系统的转染剂的壳聚糖多聚赖氨酸聚合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤一，将Sigma的低分子量壳聚糖进行高温高压处理，分两次120度40分钟，目的是得到分子量更低的壳聚糖，反应后，壳聚糖原液成深黄色；

步骤二，将所述步骤一种得到的所述壳聚糖和EDC/NHS混合后再加入多聚赖氨酸，所述壳聚糖、所述EDC/NHS、所述多聚赖氨酸的摩尔比例为1：1.5：1，利用磁力搅拌仪搅拌，加速聚合反应，反应时间为48小时；

步骤三，对所述步骤二种含有聚合物的液体进行透析提纯，利用100Ka的透析袋，将反应物置于透析袋中，室温下至于超纯水中，每12小时更换一次，持续透析4天；

步骤四，将所述步骤三得到的透析产物进行进一步提纯，利用Millipore的超滤杯，在100Ka超滤膜下进行超滤浓缩，得到最终产物壳聚糖多聚赖氨酸聚合物。

6.利用如权利要求1所述的体内基因表达蛋白系统的转染剂进行体外转染的方法，其特征在于：包括如下步骤：

第一步，对细胞进行接种，加完全培养基培养过夜；

第二步，以体积比为1：3的比例将具有待表达的蛋白基因序列质粒和壳聚糖多聚赖氨酸聚合物混合，充分混匀；

第三步，向所述第二步的混合液中加入培养基，充分混匀；

第四步，将所述第三步中的混合液加入到所述第一步中细胞培养体系中，培养24h；

第五步，更换培养基，持续观察48h至培养完毕。

7.根据如权利要求6所述的转染表达系统进行体外转染的方法，其特征在于：所述第三步加入的培养基为100μl的OMEM和20μl的DMSO。

8.根据如权利要求6所述的转染表达系统进行体外转染的方法，其特征在于：所述第三步加入的培养基为100μl的OMEM和20μl的50％的PEG3350。