[发明专利]一种超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株构建及体外诱导方法

权利要求书

1.一种超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株的构建方法，其特征在于：

包括如下步骤：

(1)合成目的基因；

(2)以合成目的基因为模板进行PCR扩增；

(3)提纯目的基因；

(4)把目的基因插入质粒中，获得重组质粒；

(5)把重组质粒转化至大肠杆菌，构建超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株。

2.根据权利要求1所述的一种超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株的构建方法，其特征在于：

所述步骤(1)的操作是根据大肠杆菌的表达特性对IFN-γ基因序列进行同源密码子优化，合成目的基因。

3.根据权利要求1所述的一种超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株的构建方法，其特征在于：

所述步骤(2)PCR扩增的一对引物中引入酶切位点序列SmaI及SalI，引物序列如下：

上游引物：CCCGGGATGAACGCTACACACTG；

下游引物：CAGCTGTCAGCAGCGACTCCTTT。

4.根据权利要求1所述的一种超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株的构建方法，其特征在于：

所述步骤(2)PCR反应条件是：98℃变性30s，诱导DNA模板双链解开；再在退火温度58℃下持续30s，使寡核苷酸引物分别结合到单链DNA模板的3’与5’端；72℃下延伸1min；35个循环。

5.根据权利要求1所述的一种超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株的构建方法，其特征在于：

所述步骤(4)的操作是将基因片段使用双酶切方法插入到热敏感质粒pBV220的多克隆位点中。

6.根据权利要求5所述的一种超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株的构建方法，其特征在于：

所述步骤(4)的详细操作是：在反应体系中分别加入SmaI及SalI核酸内切酶各1μl，Buffer 2μl，热敏感质粒pBV2201μg，无菌水补充总反应体积至20μl，在37℃反应90min，得到双酶切线性化质粒载体；

将4μl扩增获得的目的基因与1μl线性化质粒载体、0.5μl T4 DNA连接酶、1μl DNA连接酶缓冲液、3.5μl ddH₂O在无菌离心管中轻轻混合震荡，于16℃水浴过夜，得到重组质粒即IFN-γpBV220质粒。

7.根据权利要求1所述的一种超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株的构建方法，其特征在于：

所述步骤(5)的大肠杆菌是大肠杆菌MG1655。

8.根据权利要求7所述的一种超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株的构建方法，其特征在于：

所述步骤(5)的详细操作过程是：取-80℃保存的大肠杆菌MG1655菌种，使用划线法接种于LB固体培养板中，37℃培养过夜；从LB固体培养板上挑取单克隆菌落接种至含有3mlLB液体培养基的离心管中，37℃下摇晃培养过夜；吸取30μl菌液加入3ml LB液体培养基中，在摇床中以220rpm转速、37℃震荡培养，培养至菌液OD₆₀₀值达到0.5时，将菌液取出在冰上静置15min；取1ml菌液于4℃，5000rpm离心5min；吸取上清液，加入200μl预冷0.1M CaCl₂重悬，离心后加入50μl预冷的CaCl₂重悬菌体，得到感受态菌液，放置于4℃备用；在上述感受态菌液中加入5μl构建的重组质粒即IFN-γpBV 220质粒混合冰浴30min；然后将该混合溶液转到42℃水浴热激90s，再冰浴2min；再将菌液涂于含氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜后在LB固体培养板上挑取单克隆菌落，接种至5ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床培养过夜，将含有IFN-γpBV 220质粒的菌液接种于含氨苄青霉素的LB固体培养板上，得到超声响应工程菌株。

9.一种如权利要求1-8任一所述的超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株体外诱导方法，其特征在于：

步骤如下：取过夜培养的超声响应型细菌，离心收集定量至OD₆₀₀＝0.5；将菌液加入到96孔板，每孔加入200μl菌液；将拟辐照的孔板置于高强度聚焦超声(HIFU)焦点处，HIFU参数为40V，960Hz，连续波；温度稳定于45.0～45.9℃之间，辐照时间为10min；辐照后孔板放入细菌培养箱37℃培养。