[发明专利]一种单分子多组分数字免疫分析方法

说明书

一种单分子多组分数字免疫分析方法，属于生物化学与医学检测技术领域。本发明以多色荧光微球、磁纳米颗粒形成免疫复合物，以液滴分装免疫复合物，激光为激发光源，检测液滴中的荧光。荧光微球受激发射的荧光波长反映了所用抗体的种类，也即反映了抗原种类。荧光素的荧光表明液滴中是否含有抗原。微球荧光和荧光素荧光同时出现的概率用于计算抗原浓度。该方法可以用于检测血液样品中多个肿瘤标志物的同时高灵敏检测，且检测限在aM到fM的水平。

技术领域

本发明涉及一种单分子多组分数字免疫分析方法，属于生物化学分析与传感技术领域。

背景技术

实现重大疾病早期筛查、早期诊断的支撑技术是精准医学测量。蛋白质分子是医学测量的重要对象，也是疾病检测和诊断的重要标志物。免疫技术是临床检验中蛋白检测的重要医学测量分析手段，在疾病诊断、肿瘤标志物筛选、药物分析等领域中发挥着不可替代的作用。常规免疫技术对于已经发生明显症状的疾病诊断十分有效，但难以满足重大疾病早筛、神经障碍早诊、心血管疾病早检等需求，尚不能达到精准医学测量的水平。这是因为常规免疫技术灵敏度偏低，检测限偏高，仅能检测到血液中 nM - pM 浓度的抗原分子，而在重大疾病的早期阶段，血液中抗原浓度在 fM 级别甚至更低，常规免疫分析根本测量不到，更遑论精准测量。因此提高免疫技术的灵敏度至飞摩级别是实现精准医学测量的必要条件之一。实现精准医学测量的另一个必要条件是多组分免疫分析。多组分免疫分析是指同时完成同一样品中两种以上抗原的免疫分析方法，可确保测试条件一致，减小测量误差，能够大幅度降低抗原检测的假阳性和假阴性结果，提高诊断精准度。但是现有的免疫分析技术大多是单组分分析或者是以单组分串行/并行分析为基础的多指标分析不能完全满足精准测量的要求，将单组分免疫分析发展为多组分免疫分析是精准医学测量发展的必然趋势。

单分子数字免疫分析技术（Single Molecules Digital Immunoassay, SMDIA）灵敏度极高，比常规免疫分析技术检测限至少低 1000 倍，甚至于可以达到单个分子的检测水平，能够满足肿瘤早期检测，血液中稀少抗原检测等高灵敏检测的需求，是近些年免疫分析的前沿技术，被认为是下一代免疫技术。SMDIA 与传统免疫分析技术相比，既有相同点又有显著区别。相同点在于，都要将目标抗原与捕获抗体和检测抗体形成夹心结构的免疫复合体。不同部分在于，单分子数字免疫分析技术将免疫复合体离散分装到众多（几万-几百万）的微小空间中，使得绝大部分微空间中的分子个数满足泊松分布，要么含单个目标分子要么不含目标分子（仅有可忽略的部分为两个以上分子），通过识别并计数含有单个分子的微空间个数而对抗原分子定量分析。

基于液滴技术的多组分肿瘤标志物分析的单分子数字免疫分析技术尚未发现，本发明实现了这一技术。

发明内容

为了克服现有技术中存在的问题，本发明提供一种单分子多组分数字免疫分析方法，该方法仅可以对多个肿瘤标志物同时检测，检测限在aM-fM之间，满足肿瘤标志物早期筛查的要求。

本发明采用的技术方案是：一种单分子多组分数字免疫分析方法，包括以下步骤：

（1）将不同肿瘤标志物的捕获抗体连接到荧光发射波长不同的微球上，一种荧光微球对应一种肿瘤标志物。磁纳米颗粒上连接检测抗体和半乳糖苷酶。将微球、磁纳米颗粒、待测样品混合反应生成免疫复合物；

（2）在微流控芯片上利用磁力将未形成免疫复合物的游离磁纳米颗粒从支路吸引流至废液池；

（3）将免疫复合体、荧光微球以及荧光酶底物驱动进入液滴生成系统，分装到液滴中；

（4）液滴依次穿过激光焦斑，发出的荧光用于待测样品中抗原分子的定性定量；

（5）荧光微球受激发射的荧光波长反映了肿瘤标志物种类。荧光素的荧光表明液滴中是否含有抗原。微球荧光和荧光素荧光同时出现的概率用于计算抗原浓度。