[发明专利]双指标筛选新冠病毒及预判重型肺炎的方法

权利要求书

1.检测血清、血浆和全血中的新型冠状病毒SARS-CoV-2IgA抗体和涎液化糖链抗原KL-6的试剂在制备用于作为早期筛选新型冠状病毒感染肺炎并预判重型患者的检测试剂盒中的用途，重型患者为出现肺损伤或者纤维化的患者；检测所述SARS-CoV-2IgA抗体的SARS-CoV-2重组抗原是SARS-CoV-2刺突蛋白（简称S蛋白）RBD，该RBD蛋白截取的是SARS-CoV-2 S蛋白Gln321-Ser591位氨基酸序列；或者检测所述SARS-CoV-2IgA抗体的SARS-CoV-2重组抗原是SARS-CoV-2核衣壳蛋白（简称N蛋白）片段，该蛋白片段截取的是SARS-CoV-2 N蛋白Met1-Ala419位氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：试剂盒含有测试卡，测试卡由SARS-CoV-2IgA测试条、KL-6测试条和塑料盒组成；

每个测试条均含有硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫、吸水纸和PVC板支持物；

SARS-CoV-2IgA测试条的硝酸纤维素膜包被有抗人-IgA抗体，结合垫含有胶体金标记的SARS-CoV-2重组抗原；

KL-6测试条的硝酸纤维素膜包被有抗人-KL-6单克隆抗体和抗鼠IgG多克隆抗体，结合垫含有胶体金标记的抗人KL-6抗体。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：

SARS-CoV-2重组抗原的蛋白表达过程是：将SARS-CoV-2S蛋白RBD基因在C端通过一个TEV酶切位点序列连接人IgG1 Fc，然后将其克隆到哺乳动物表达载体pTT5并在翻译起始区加入了Kozak序列，然后转染到悬浮培养细胞HEK293F中，使用干扰素α-1作为信号肽使HEK293F细胞分泌RBD-TEV-Fc融合蛋白，再采用Protein A柱子和镍柱进行两次纯化；第一次纯化为采用Protein A柱子从培养基上清中获得RBD-TEV-Fc融合蛋白；第二次纯化为采用带有6His tag的TEV酶对融合蛋白进行酶切，将酶切产物依次流过Protein A柱子和镍柱，除去Fc、TEV酶以及第一次纯化时结合Protein A柱子的杂蛋白，最终在流穿中获得纯净的RBD蛋白；或者

SARS-CoV-2重组抗原的蛋白表达过程是：将SARS-CoV-2N蛋白片段的基因在N端连接6His tag并克隆到原核表达载体pET28a中，再转化到大肠杆菌细胞BL21中进行蛋白表达，然后取破碎细菌在细菌裂解液中加入0.5-2.0M氯化钠，降低蛋白与核酸非特异性结合，再将裂解液过镍柱，洗脱后加入终浓度为0.25-1.0M的硫酸铵室温搅拌10-20min，使得蛋白暴露其疏水核心，再采用疏水柱进一步纯化蛋白，然后采用superdex-200分子筛除去多聚体及其它杂蛋白，最终获得高纯度构象统一的N蛋白片段。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：

试剂盒还含有样本稀释液，所述样本稀释液为pH7.1—7.4的Tris盐酸缓冲液，内含2-8％的牛血清白蛋白(w/v)、0.05-0.2％吐温20(v/v)、0.25-1％Proclin300(v/v)。