[发明专利]一种培养间充质干细胞提取外泌体的方法、外泌体冻干剂及制备方法

权利要求书

1.一种培养间充质干细胞提取外泌体的方法，其特征在于，包括：

对组织块进行平皿贴壁培养，所得间充质干细胞制备成间充质干细胞悬液；

将所述间充质干细胞悬液导入中空纤维培养装置中进行中空纤维培养，收集所述中空纤维培养装置外空间培养上清液；

对所述培养上清液进行离心、过滤，提取外泌体。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组织块的来源为脐带。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述对组织块进行平皿贴壁培养，所得间充质干细胞制备成间充质干细胞悬液；包括：

组织块用0.125％-0.25％胰酶消化8min-15min，离心300g-450g、5min-10min，离心完毕后去掉上清液，留下组织；

将组织分成1mm-5mm大小的组织块进行平皿贴壁，将平皿倒置搁放37℃、CO₂培养箱20min-30min，每皿加入3ml-5ml DMEM培养基培养；

连续培养每隔1天半量换液，收集培养液，待细胞贴壁，去除组织块，收集培养液；

每皿待贴壁细胞生长至融合度80％以上，收集培养液，用PBS缓冲液清洗，0.125％-0.25％胰酶消化，去除胰酶，将细胞传至培养瓶中继续传代培养，细胞传代扩增至2代之后，收集培养液，用PBS清洗，0.125％-0.25％胰酶消化，去除胰酶制备含DMEM培养基的间充质干细胞悬液。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中空纤维培养的方法为：

将所述间充质干细胞悬液导入中空纤维培养装置中培养，每2-5天收集培养上清液，并更换新鲜的培养基；

培养至28-35天后终止培养，连续培养过程中收集中空纤维培养装置外空间培养上清液。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对所述培养上清液进行离心、过滤，提取外泌体；包括：

将所述培养上清液在300g～400g离心10min～20min，收集上清液，弃沉淀；

收集的上清液在2000g-3000g离心40min～60min，继续收集上清液，弃沉淀；

收集的上清液用0.22μm孔径过滤器进行过滤，收集过滤液；

在超滤装置上超滤上清液，滤膜的孔径为30-60nm；

超滤完毕后，加入PBS缓冲液并再次超滤，重复3-5次；用PBS缓冲液洗涤滤膜上的外泌体，制得外泌体浓缩液，并进行冷藏保存。

6.一种外泌体冻干剂，其特征在于，包括：

外泌体、氯化钠、普鲁兰、海藻糖、甘露醇、右旋糖酐、葡萄糖、乳酸钠、氯化钾、白蛋白、丝蛋白和华通氏胶。

7.如权利要求6所述的外泌体冻干剂，其特征在于，按外泌体的重量百分比计，各成分的加入量包括：

0.9％氯化钠、1％-5％普鲁兰、1％-5％海藻糖、1％-5％甘露醇、5％-10％右旋糖酐、0.5％-1％葡萄糖、0.5％-1％乳酸钠、氯化钾、5％-10％白蛋白、1％-5％丝蛋白和2％-5％华通氏胶。

8.一种如权利要求6或7所述的外泌体冻干剂的制备方法，其特征在于，包括：

在外泌体中加入普鲁兰、海藻糖、甘露醇、右旋糖酐、葡萄糖、乳酸钠、氯化钾、白蛋白、丝蛋白和华通氏胶；

用0.22μm滤膜过滤，分装后，三秒内瞬间液氮冻干休眠；

用超真空冷冻干燥箱，将活性物在真空环境下干燥6小时，将冻干获得的试剂中所含的冰结晶升华排出，最终得到疏松多孔，遇水即崩解冻干产品。