[发明专利]一种新冠肺炎反义RNA多价疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种新冠肺炎反义RNA多价疫苗的制备方法，其特征在于，由shRNA/Ad5、siRNA/LHNPs和喷雾剂按比例配制而成，其中shRNA/Ad5：siRNA/LHNPs：喷雾剂的质量比、摩尔比或体积比=1：1：2～20；所述shRNA/Ad5指经SARS-CoV-2的靶向干扰基因shRNA的PCR扩增、干扰载体pSilencer-shRNA和穿梭载体pDC312-shRNA的构建、穿梭载体pDC312-shRNA与腺病毒骨架质粒pBHGloxAEl的同源重组而获得，接种后通过shRNA自产反义RNA而起作用，侧重于预防；所述siRNA/LHNPs指经SARS-CoV-2的RNA干扰靶基因siRNA的体外合成、负载siRNA的脂质纳米粒载体的制备而获得，接种后通过siRNA转化为反义RNA而起作用，侧重于基因治疗；所述喷雾剂包括水、甘露醇或常规医用喷雾剂；将不同作用机制的疫苗配制使用，能起到补缺增效作用，可避免因单价疫苗免疫失败引起的严重后果。

2.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎反义RNA多价疫苗的制备方法，其特征在于，所述靶向干扰基因shRNA指位于ORF1ab、3'UTR、S、E、M或N基因组区域的保守基因，能用shRNA在线设计软件获得siRNA序列及表达发夹结构的shRNA模板，其PCR扩增的目标产物用于构建干扰载体pSilencer-shRNA，与所获siRNA序列互补的shRNA序列为RNA干扰靶点，能被所制shRNA/Ad5产生的siRNA反义链互补结合而降解。

3.根据权利要求1、2所述的一种新冠肺炎反义RNA多价疫苗的制备方法，其特征在于，所述干扰载体pSilencer-shRNA的构建是指用shRNA在线设计软件获得长度为19nt的siRNA序列，结合空干扰载体pSilencer 4.1-CMV neo的多克隆位点的酶切位点，设计出可以表达发夹结构的shRNA模板，每个模板由两条大部分互补的55bp的单链DNA构成，退火互补后能形成带有BamH I和Hind III酶切位点粘性末端的DNA双链，该DNA双链与干扰载体pSilencer 4.1-CMV neo进行连接后而构建。

4.根据权利要求1、2所述的一种新冠肺炎反义RNA多价疫苗的制备方法，其特征在于，所述 shRNA/Ad5指当携带shRNA的重组腺病毒载体Ad5到达靶细胞后，以shRNA为模板复制dsRNA，dsRNA被切割为siRNA，siRNA双链裂解为正义链和反义链，反义链与胞质的内切酶、外切酶和解旋酶等结合生成基因沉默复合物RISC，RISC再通过反义链与SARS-CoV-2的RNA和/或mRNA互补结合，在结合处切割、降解RNA或mRNA，产生基因沉默，而且siRNA还可作为引物与SARS-CoV-2的靶基因结合并在RNA聚合酶和Dicer的作用下生成更多的siRNA，从而进一步放大RNA干扰作用，最终使SARS-CoV-2的靶基因被完全降解。

5.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎反义RNA多价疫苗的制备方法，其特征在于，所述脂质纳米粒的内层包含类脂质环氧烷基胺衍生物EAAD、siRNA和聚乳酸羟基乙酸PLGA，中层为能提高载体生物相容性的脂质体，外层为能提高载体结构稳定性的PEG。

6.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎反义RNA多价疫苗的制备方法，其特征在于，所述siRNA的体外合成指由A、U、C、G这四种单核苷酸制成；所述单核苷酸包括未经化学修饰的单核苷酸和/或经化学修饰的单核苷酸；所述化学修饰包括4'-C-甲基修饰、硫代磷酸酯修饰、烷磷酸酯修饰、键连接核酸修饰和/或糖环修饰；所述糖环修饰包括2'-Ome修饰、2'-F修饰、2'-MOE修饰、2'-OCE修饰、2'-EA修饰、2'-OH修饰、4'-S修饰、2'-OMe修饰、2'-MOE修饰、Me-SRNA修饰和/或F-SRNA修饰；所述核酸合成方法指采用核酸固相合成法在体外合成SARS-CoV-2 siRNA。