[发明专利]含有干细胞激活剂的培养基及间充质干细胞的培养方法

说明书

本发明公开了含有干细胞激活剂的培养基及间充质干细胞的培养方法，培养方法为：1)将间充质干细胞用细胞培养基培养至80％的融合度后，弃去培养基；加入含干细胞激活剂的培养基；培养；清洗；2)加入复方电解质溶液，培养，按半量体积收集培养上清液；3)加入半量体积复方电解质溶液，培养，按半量体积收集培养上清液；4)重复步骤3)4‑8次；5)将收集的培养上清液过滤浓缩，纯化、除菌，获得干细胞因子群。本发明的方法获得的干细胞因子持续稳定，浓度高，不含牛血清成分，不含动物源成分，不含过敏源，本发明的方法操作简便，成本低，干细胞因子原液可以制备成不同的干细胞因子制剂产品，适合不同的适应症和不同的给药方式。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种干细胞激活剂及含有干细胞激活剂的培养基以及应用该培养基利用间充质干细胞生产干细胞因子群的方法。

技术背景

间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是一类具有自我更新和多向分化潜能的干细胞。它具有造血支持、免疫调控、血管新生、组织损伤的修复等生物学特性。MSC具有分化潜力大、增殖能力强、归巢迁移能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，因此是最具临床应用前景的多能干细胞。

间充质干细胞的作用主要体现在两个方面，一是替代作用，可以分化成很多组织细胞，修复替代损伤的组织；二是旁分泌作用，可以分泌很多的细胞因子，进而参与组织的修复。旁分泌效应分泌的细胞因子主要包括这几类：抗凋亡因子、免疫调节因子、抗瘢痕因子、造血支持因子、血管生成因子等等；越来越多的实验结果表明MSC在体内的分化和替代的比例很小，在免疫健全的动物体内的定植和分化的细胞数量甚微。而治疗作用绝大部分是通过强大的旁分泌作用来实现的。MSC通过分泌血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)和胸腺素β4(Tβ4)等来保护缺血性心肌细胞，促进心肌再生。MSC通过分泌一系列的生长因子例如HGF,VEGF,SDF-1,角质细胞生长因子(KGF),bFGF,胎盘生长因子(PGF),转化生长因子β(TGFβ),单核细胞趋化蛋白(MCP)-1和IGF-1来促进增殖和组织损伤修复。MSC通过分泌抗炎因子如白介素10(IL-10)和肿瘤坏死因子诱导蛋白6(TSG-6),抑制促炎因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)和γ干扰素(IFN-γ)表达来发挥抗炎作用。间充质干细胞因子群具有间充质干细胞的抗炎、免疫调节，抗瘢痕，促血管新生的生物学功能，其生物学活性与细胞相当，通过与体内的相应的受体配体结合，可以快速发挥生物学效应，干细胞因子作为蛋白质，其储存和运输与蛋白生物制剂相同，比间充质干细胞的储存和运输成本低，更方便临床应用。

越来越多的研究证明干细胞因子可以发挥与干细胞相当的作用，包括抗凋亡，免疫调节，修复再生，血管新生调节和动员内源性的干细胞。干细胞因子可以用于治疗神经损伤、肾损伤、肝损伤、关节损伤、骨损伤等疾病。干细胞因子包含了上百种细胞因子和化学因子，其中HGF,VEGF,TGFβ,bFGF是其主要的代表性因子。

传统的细胞上清的收集方法是使用含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基的方法进行培养，然后收集培养上清，这种方法收集的上清中细胞因子的表达量低，且随着细胞的代次增加，其生物学特性会发生改变，从而造成干细胞因子群的表达变化，影响其生物学功能。产品均一性不能保证。