[发明专利]一种适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法

权利要求书

1.一种适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1、培养真菌，离心收集，得到菌体；

S2、向菌体中加入山梨醇buffer及破壁酶，充分混匀后孵育，离心收集得到菌体沉淀；

S3、向菌体沉淀中加入蛋白酶K及裂解液混匀，加入异丙醇及磁珠悬浮液后，再次振荡混匀；

S4、将离心管放入金属浴进行孵育，期间交替进行振荡混匀和静置；

S5、将孵育后离心管放置于磁力架静置，磁珠吸附后，吸除液体；

S6、取下离心管，加入清洗液，振荡混匀，然后将离心管放置于磁力架静置，磁珠完全吸附后，吸除液体；

S7、取下离心管，加水，振荡混匀，放入金属浴孵育，期间颠倒混匀；

S8、将离心管放置于磁力架静置，磁珠完全吸附后，将DNA溶液转移到新离心管中，即得。

2.根据权利要求1所述的适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤S3中裂解液的组成为：5mM乙二胺四乙酸、450mM三羧甲基氨基甲烷、450mM氯化钾、300mM氢氧化钠、8mM二硫苏糖醇、1％曲通、0.03％N-月桂酰肌氨酸钠。

3.根据权利要求1所述的适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤S3中异丙醇的加入量为350μL，磁珠悬浮液的加入量为20μL。

4.根据权利要求1所述的适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤S3中蛋白酶K的加入量为20μL，裂解液的加入量为300μL。

5.根据权利要求1所述的适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤S6中清洗液的组份为：0.3M PH值为4.0的氯化钾溶液。

6.根据权利要求1所述的适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤S1具体包括如下步骤：1a、使用液体培养基培养真菌，用时36-72小时；1b、取菌体于离心管中，然后以12000r/min的转速离心10min，收集菌体。

7.根据权利要求1所述的适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤S2具体包括如下步骤：向菌体中加入600μL山梨醇buffer，然后加入5μL浓度为10U/μL破壁酶Lyticase，破壁酶的活性为50U,充分混匀，30℃孵育30min，以1800r/min的转速离心10min，弃上清，收集沉淀。

8.根据权利要求1所述的适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤S4具体包括如下步骤：将离心管置于金属浴中65℃孵育15min，期间颠倒混匀3回，每回4-6次；室温放置5min；振荡混匀1min，共静置9min，每3min振荡混匀1min。

9.根据权利要求1所述的适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤S7具体包括如下步骤：取下离心管，加入100μL水，振荡混匀；放入56℃金属浴孵育10min，期间颠倒混匀3回，每回4-6次。

10.根据权利要求1所述的适用于PCR扩增的真菌基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述真菌为曲霉属真菌，在步骤S1和S2之间还包括如下步骤：

(1)将菌体置于离心管中，用冷去离子水清洗3遍；然后将菌体移于50mL离心管中使其悬浮于浓度为0.2mol/L、pH值为8.0的25mL磷酸缓冲液中；

(2)离心收集到离心管中，加入500μL磷酸缓冲液，再加8g氧化锆珠(直径3mm)及0.3g氧化锆珠(直径0.2mm)，配平后放入组织破壁仪，设置研磨条件为：1800r/min，研磨时间99s，间隔时间10s，6个循环，一键自动研磨；然后将菌液及氧化锆珠等分开，留菌液。