[发明专利]一种鉴别大米草和互花米草的方法

说明书

本发明提供一种鉴别大米草和互花米草的方法，该方法包括向待检样品DNA中加入设计的引物并进行扩增。本发明的方法通过稳定差异的DNA片段来开发了一种分子标记区分方法，仅通过简单的PCR和琼脂糖凝胶电泳结果就能进行两个物种的鉴别和区分，成本低、操作简单、快速、准确，为检验检疫带来便利。

技术领域

本发明涉及外来入侵物种的鉴定鉴别，并具体涉及一种鉴别大米草和互花米草的方法。

背景技术

生物入侵已成为威胁全球生物多样性保护最主要的因素之一，随着我国全球贸易和旅游业的发展，我国幅员辽阔的疆土和复杂多样的自然环境为各类外来生物提供了优越的生存空间，已成为世界上遭受外来生物入侵最为严重的国家之一。

互花米草(Spartina alterniflora)和大米草(S.anglica)是两种禾本科米草属植物。互花米草原产于北美地区，是我国滨海滩涂湿地典型的外来入侵植物，也是被列入《中国第一批外来入侵物种名单》中的外来物种之一。互花米草引入英国后，与当地的欧洲米草(S.maritima)杂交产生不育的6倍体杂交型S.×townsendii，随后S.×townsendii在自然条件下染色体加倍形成了可育的12倍体物种大米草，随后大米草迅速在欧洲各国滨海滩涂扩散。1963-1964年，我国先后从英国和丹麦引进大米草种子，并在全国10个省(市、区)的沿海滩涂种植，1979年我国又从美国引入互花米草。至今，大米草种群已急剧退缩，仅有个别省存有，而互花米草已扩张至我国几乎全部的沿海海岸，北至辽宁，南至广西。互花米草侵占光滩，影响鸟类迁徙和栖息，并入侵红树林，抢占本土滨海湿地植物生态位，已经严重破坏了我国沿海滩涂生态环境，并对沿海经济造成了巨大影响。因此，在入侵物种的防控上对互花米草和大米草的区分具有重要意义，尤其对出入境检验检疫。传统植物鉴定方法主要依靠形态学对比和观察鉴定，由于大米草是互花米草的杂交后代，在形态上非常难以区分，对鉴定技术力量要求较高，因此利用分子技术对两种物种进行区分对检验检疫以及防控治理有重要的现实意义。

目前，应用于植物物种鉴定的常用DNA分子标记主要包括叶绿体基因片段、核糖体内转录间隔区ITS、微卫星标记(SSR)、以及单核苷酸多态性(SNP)。但由于互花米草和大米草基因组庞大，分别为六倍体和十二倍体，并且互花米草是大米草的母系来源，因此使用叶绿体基因片段无法区分两个物种，而微卫星等传统分子标记在多倍体材料中又普遍存在实验结果一致性较差，假阳性率高，信息损失等问题。并且因杂交起源，大米草ITS及部分核基因序列的一代测序结果更是存在套峰严重，无法准确判定位点碱基等负面因素。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述问题，利用高通量简化基因组测序技术(Restriction site associated DNA sequence，RAD-seq)筛选出互花米草和大米草之间具有稳定差异的DNA片段，并以此为基础开发的分子标记区分方法，该方法能够准确、简单、快速地鉴别互花米草和大米草。

具体地，本发明方法的研究过程为：使用上述简化基因组技术(RAD-seq)测序获得大米草和互花米草的基因信息。RAD-seq技术不需要了解物种基因信息就能够获得大量的SNP位点，该技术已广泛的应用于变异检测、遗传图谱构建、功能基因挖掘、群体进化等研究。RAD-seq技术的测序步骤是：通过限制性内切酶将总DNA切割成一定大小的DNA片段(例如，一般为300～500bp大小的DNA片段)，将所获片段两端连接接头，随后进行DNA片段分选构建文库，文库扩增后采用Illumina Xten平台进行高通量测序，使用Stacks v1.31软件对测序数据进行数据质控和拼接，获得简化基因组序列。对所获得的大米草和互花米草简化基因组序列进行筛选，找到能够稳定区分两个物种的DNA片段S65，大米草特有的S65序列如下所示(亦如本发明的核苷酸序列表中SEQ ID NO:1所示)：

在此基础上，本发明提供的S65引物序列如下(如本发明的核苷酸序列表中SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示)：