[发明专利]一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠杆菌的构建方法及应用

说明书

本发明公开一种提高聚羟基丁酸乳酸酯中乳酸组分含量的基因工程大肠杆菌的构建方法及应用，改造途径为构建由丙酮酸合成聚羟基丁酸乳酸酯代谢途径，过表达2‑羟基丙酰‑CoA合成途径中相关基因以增加LA‑CoA的合成，改造途径还包括削弱大肠杆菌内源性硫酯酶ydiI和yciA中的一种或两种，以减少LA‑CoA流向乳酸合成途径。本发明将大肠杆菌体内的LA‑CoA有效的流向目标产物的合成模块，减少目标产物合成前体LA‑CoA的浪费，通过对代谢途径的分析和调控，利用基因工程手段对大肠杆菌进行改造，获得的重组菌株产生的聚羟基脂肪酸酯中乳酸组分含量明显增加。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，更具体地讲，涉及利用葡萄糖或木糖生产聚羟基丁酸乳酸酯的基因工程大肠杆菌菌株的构建方法及应用。

背景技术

目前，常用的塑料大多是由石油和天然气等化石燃料合成的，导致了全球变暖及固体废弃物积累等环境问题，这些问题催促我们开发利用可持续的原料生产生物基聚合物。聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxy alkanoates,PHA)是由微生物产生的一种聚酯，目前因其生物可降解性、光学性能和生物相容性等优良性质引起了研究者的广泛关注。

聚乳酸是一种很有前景的生物质衍生聚合物，因为它可以替代石油基塑料，具有几种理想的性质，如生物降解性，生物相容性和可堆肥性，聚乳酸本身无毒，但是传统生化方法生产中的金属催化剂残留会影响其在医学等方面的应用。可惜目前由于缺乏天然的乳酸聚合酶，无法实现在生物体内一步生产。 Seiichi Taguchi等利用底物相似性原则，通过对PHA合成酶进行突变成功地创造了微生物生物合成乳酸基聚酯的体系——聚3羟基丁酸乳酸酯P(3HB-co-L A)。

P(3HB-co-LA)是PHA家族的一种，该聚合物融合了单独的聚乳酸透明且坚硬以及聚3-羟基丁酸不透明且易碎的特点，根据乳酸含量从而表现出不同的弹性和透明度。

P(3HB-co-LA)由经过突变的具有乳酸聚合活性的PHA合成酶催化3-羟基丁酰辅酶A(3HB-CoA)和2-羟基丙酰-CoA(乳酰辅酶A，LA-CoA)合成。为了进一步提高乳酸组分含量，研究者尝试经过厌氧发酵使前体物质乳酸积累量增加，结果聚合物中乳酸的摩尔比大幅度增加到47mol％，但由于厌氧状态对于细胞生长有一定的阻碍作用，使得聚合物干重有所下降，仅占菌体的2 wt％。Nduko等尝试对碳源优化，以木糖作为碳源时，在改造后的大肠杆菌细胞合成的聚合物中，乳酸组分达到34mol％，相比于在葡萄糖中的26mol％有了较大幅度提升，当对PHA合成酶进一步优化后，乳酸组分再次提高到60 mol％。

日本科学家Seiichi Taguchi发现，在大肠杆菌中引入突变的PHA合成酶、丙酸辅酶A转移酶、β酮硫解酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶合成的P(3HB-co-LA) 中，乳酸组分含量都在70％以下，而同一套体系在谷氨酸棒杆菌中表达，产生的P(3HB-co-LA)中，乳酸组分含量在96.8-99.3％，进一步研究发现，谷氨酸棒杆菌体内的LA-CoA处于较高水平，几乎和乙酰CoA同等浓度，但大肠杆菌体外的LA-CoA几乎检测不到。说明存在对LA-CoA有活性的降解酶，导致了 LA-CoA的降解，缺失这种降解酶将对提高P(3HB-co-LA)中的乳酸组分含量具有重要意义。但目前在大肠杆菌中，关于降解LA-CoA的酶没有被报道。硫酯酶能水解化合物中羰基和硫原子之间的硫酯键的一大类酶，可以通过裂解酰基 CoA中间体中硫酯键形成游离的羧酸和CoA，由Tillander等科学家首次在大肠杆菌中检测到。