[发明专利]单碱基编辑介导的剪接修复在制备治疗脊髓性肌萎缩症中的应用

权利要求书

1.一种增加功能性SMN2蛋白表达的方法，其特征在于，该方法包括：靶向SMN2基因7号外显子，变异其中一个或多个碱基；较佳地，所述的一个或多个碱基为该7号外显子的第4、5、6、36、38和/或45位碱基。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述7号外显子的第4、5或6位碱基被变异为碱基C；或所述7号外显子的第36、38或45位碱基被变异为G。

3.如权利要求1～2任一所述的方法，其特征在于，

所述7号外显子的第36位变异为G，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸不变；

所述7号外显子的第45位变异为G，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸不变；

所述7号外显子的第36位和第38位变异为G，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸由Ser-Ser变异为Ser-Arg；

所述7号外显子的第4位和第5位变异为C，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸由Phe变异为Pro；

所述7号外显子的第5位变异为C，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸由Phe变异为Ser；或

所述7号外显子的第6位变异为C，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸不变。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，利用基因编辑、定点突变或同源重组来进行SMN2基因7号外显子的变异；较佳地，利用单碱基编辑介导的剪接修复来进行基因编辑。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述单碱基编辑介导的剪接修复利用DNA单碱基编辑器进行；较佳地所述DNA单碱基编辑器为腺嘌呤碱基编辑器或其变体；更佳地，所述腺嘌呤碱基编辑器包括以下操作性连接的元件：TadA和/或TadA*，Cas9n。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述腺嘌呤碱基编辑器或其变体包括以下操作性连接的元件：

ABE：TadA-TadA*，Cas9n或Cas9n-KKH；

ABEmax^F148A：TadA^F148A-TadA*^F148A，Cas9n或Cas9n-KKH；

MiniABEmax：TadA*，Cas9n或Cas9n-KKH；

miniABEmax^V82G：TadA*^V82G，Cas9n/Cas9n-KKH；

较佳地，在其氨基端和/或羧基端还包括核定位序列。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，利用SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:8所示序列的sgRNA进行碱基编辑。

8.如权利要求5～7任一所述的方法，其特征在于，所述方法应用于诱导性多能干细胞、胚胎干细胞、生殖细胞或体细胞，该细胞中SMN2基因编码截短的SMN2蛋白；所述方法包括：提供针对SMN2基因7号外显子的sgRNA以及DNA单碱基编辑器，引入到所述细胞中。

9.一种SMN2基因突变体，其核苷酸序列的7号外显子上发生一个或多个碱基的变异，所述变异存在于该7号外显子的第4、5、6、36、38和/或45位碱基上。

10.如权利要求9所述的SMN2基因突变体，其特征在于，所述7号外显子的第4、5或6位碱基被变异为碱基C；或所述7号外显子的第36、38或45位碱基被变异为G。