[发明专利]异宗毁丝霉糖化酶MhglaA及其编码基因和在葡萄糖生产中的应用

说明书

本发明公开了一种具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的嗜热真菌糖化酶MhGlaA，及其编码基因；通过FMDV 2A肽介导的包含该基因和GFP基因的表达盒和重组表达载体；还公开了提高嗜热毁丝霉中的生产糖化酶的方法，以及在在水解淀粉中的应用。本发明所提供的糖化酶pH值适用范围广，热稳定性好，对淀粉的水解效果显著，尤其通过获得的最优嗜热毁丝霉重组菌株，其生产糖化酶的产量比野生型菌株提高约12.5倍，其糖化酶活力比野生型提高约8.5倍，其发酵液对淀粉的水解效果显著优于野生型发酵液，因而具有较高的应用价值。

技术领域

本发明属于基因工程和生物技术领域。具体地，本发明涉及涉及一种异宗毁丝霉糖化酶MhGlaA及其基因和生产应用。

背景技术

糖化酶全称为葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase，EC 3.2.1.3)，广泛应用于啤酒、味精、淀粉糖、抗菌素等要求淀粉最大限度转化为葡萄糖的工业领域，是工业生产中最重要的酶类之一。糖化酶的主要生产菌种为霉菌，我国多用红曲霉、黑曲霉以及根霉。我国糖化酶主要是由黑曲霉优良菌种经深层发酵精制提炼而成。我国淀粉加工用酶行业经过几十年的发展，虽然已经可以自主生产糖化酶等大宗酶制剂品种，但是仍然存在酶制剂性能不高，发酵水平偏低的问题。

大多数糖化酶并不耐高温，目前工业应用的糖化酶其耐受温度一般在85℃以下，超过该温度后，酶活力损失巨大，甚至完全失活；另外，大多数真菌糖化酶的pH作用范围较窄，最适反应pH值一般为4.0-5.0，在酸性条件下稳定，因此需要调整温度和pH后才能进入糖化过程，这些均从一定程度上限制了糖化酶的应用(Kumar P,Satyanarayana T(2009)Microbial glucoamylases:characteristics and applications.Crit Rev Biotechnol29:225-255)。如CN1284129A中公开一种适合于淀粉转化过程的来源于Talaromycesemersonii的分离的热稳定葡糖淀粉酶，在70℃下在50mM NaOAc、0.2AGU/ml、pH4.5中具有至少100分钟的T1/2(半衰期)，与黑色曲霉AMG相比，在60℃下针对麦芽糖具有增加的比活性。US4247637公开了一种来源于Talaromyces duponti热稳定葡糖淀粉酶，当在70℃、pH4.5下保持10分钟时，保留酶活至少约90％。

可见目前，如何进一步提高糖化酶的热稳定性、低pH稳定性，降低转苷活性等是糖化酶研究的热点。Volkov PV等(Glucoamylases from Penicillium verruculosum andMyceliophthora thermophila:analysis of differences in activity againstpolymeric substrates based on 3D model structures of the intactenzymes.Biochimie,2015,110:45-51)研究了嗜热毁丝霉糖化酶MYCTH_72393，其是通过最传统的直接嗜热毁丝霉菌株发酵液中进行分级纯化得到酶，然后质谱检测发现是MYCTH_72393，仅研究该酶的最适pH、底物水解特性和3D结构，但并没有涉及任何分子克隆技术和基因工程的改造研究。

因此，有必要开发一种性能优良的糖化酶，提高其耐热性能及pH作用范围，从而降低能源消耗及生产成本，以及糖化酶生产能力优异的重组菌株，以满足我国淀粉加工工业对高性能、低成本酶制剂的需求，具有重要的商业价值。

发明内容