[发明专利]重组菌株及其在L-色氨酸制备中的应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及重组菌株及其在L‑色氨酸制备中的应用。本发明提供了突变的mg1B蛋白及编码该蛋白的核酸分子，菌株中含有1amB^Tyr143Leu，mg1B^Thr31Ser突变，则该菌株被赋予异麦芽糖的利用能力。在过表达glvA基因和glvC基因的菌株中引入上述突变，则该菌株具有利用异麦芽糖能力且可以产生L‑色氨酸，本发明进一步的提供了利用该微生物生产L‑色氨酸的方法。更具体地，本发明涉及通过改造加进化的方式可利用异麦芽糖，从而更具有提高L‑色氨酸生产能力的大肠杆菌，以及利用该微生物生产L‑色氨酸的方法。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及重组菌株及其在L-色氨酸制备中的应用。

背景技术

L-色氨酸是芳香族必需氨基酸的一种，分子式为C₁₁H₁2N₂O₂，白色至黄白色晶体或结晶性粉末。无臭或微臭，长时间光照则着色。与酸在暗处加热较稳定。与其他氨基酸、糖类、醛类共存时极易分解。

L-色氨酸被广泛应用于医药、食品和饲料等领域。在医药领域，是氨基酸输液的重要组分和重要的医药中间体，可用于孕妇营养补剂和乳幼儿特殊奶粉，用于烟酸缺乏症(糙皮病)治疗药，作为安神药，调节精神节律、改善睡眠。在食品应用领域，色氨酸可用于强化食品，提高风味，也可用于面包促进发酵。在饲料领域，色氨酸还可促进动物的采食、削弱应激反应、改善动物睡眠，还可以增加胎儿和幼仔的抗体、提高乳畜泌乳。降低日粮优质蛋白用量，节约饲料成本，降低日粮蛋白饲料用量，节约配方空间等。

L-色氨酸可由化学合成法、蛋白质水解法，酶促转化法、直接发酵法、添加前体发酵法进行生产。目前主流生产方法为直接发酵法。

目前工业上生产氨基酸，常已甘蔗糖蜜等廉价原料为碳源，在L-色氨酸发酵生产中也不例外，以糖作为原料添加在培养基中。甘蔗糖蜜中含有大量的淀粉，而很少直接作为原料进行添加，而是在淀粉酶等糖化酶液的作用下，变为淀粉水解液，主要成分是单糖葡萄糖，除此之外，还含有二糖麦芽糖、异麦芽糖或者三糖潘糖等这样的小分子糖。在发酵过程中，当使用淀粉水解液作为原料时，发酵一定程度仅作为主要成分葡萄糖可以被完全消耗，而麦芽糖、异麦芽糖、潘糖等杂糖不能被利用，他们将与L-氨基酸发生美拉德反应，使氨基酸在纯化步骤成为问题，影响提取的收率。因此，降低发酵培养基剩余的杂多糖，可减少提取压力，提高产品纯度，进而节约生产成本，增加效益。

早期，已有研究人员发现在酿酒酵母中，存在基因AGT1，其编码Agtlp蛋白质，可将麦芽糖、异麦芽糖、麦芽三糖等各自α-糖苷摄入到菌体(Han，E.K.，et al.，MolecularMicrobiology.1995，17，1093.)。异麦芽糖的同化除了需要异麦芽糖转运蛋白以外，还需要异麦芽糖酶存在，研究人员发现在枯草芽孢杆菌中存在malL基因，编码α-糖苷酶，可水解蔗糖、麦芽糖、异麦芽糖等多糖(Michael K.Dahl.，et al.，Joumalofbacteriology，1998，2574-2578)。2001年，研究人员发现，在肺炎克雷伯氏菌中，存在aglB和aglA基因，其中aglA基因编码转运蛋白，可将蔗糖、麦芽糖、异麦芽糖、海藻糖等摄入到胞内，aglB基因编码磷酸-α-葡萄糖苷酶，将6-磷酸-α-糖苷分解为葡萄糖等，将多糖进行利用(John Thompson，etal.，The Journal of Biological Chemistry.2001，37415-37425)。

大肠杆菌遗传背景更清晰，且培养条件简单，将其作为基因工程菌株具有发酵操作简单的优势，但以大肠杆菌为代表的肠杆菌科细菌群通常不能同化异麦芽糖，也不能确定其是否能够将异麦芽糖摄入到菌体内。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供重组菌株及其在L-色氨酸制备中的应用，该菌株以大肠杆菌为底盘菌，能够利用异麦芽糖，且能够产生L-色氨酸。