[发明专利]抗人乳头瘤病毒药物筛选模型及其构建方法及应用

权利要求书

1.抗人乳头瘤病毒药物筛选模型，其特征在于，所述药物筛选模型为包含HPV1环状DNA与携带报告基因质粒的HaCaT细胞，命名为HPV1模型细胞；或者所述药物筛选模型为包含HPV11环状DNA与携带报告基因质粒的HaCaT细胞，命名为HPV11模型细胞。

2.根据权利要求1所述的药物筛选模型，其特征在于，所述报告基因为抗生素抗性基因，优选新霉素抗性基因。

3.根据权利要求2所述的药物筛选模型，其特征在于，携带报告基因的质粒为pRP-Neo；其中，质粒pRP-Neo是以pRP为出发载体，通过Gateway技术用新霉素抗性基因替换出发载体上的ccdB-cmR序列得到的；

优选地，HPV1环状DNA与质粒pRP-Neo的摩尔比为2：1-4：1；HPV11环状DNA与质粒pRP-Neo的摩尔比为2：1-4：1。

4.抗人乳头瘤病毒药物筛选模型的构建方法，其特征在于，用HPV1环状DNA或HPV11环状DNA与质粒pRP-Neo共转染HaCaT细胞，经G418筛选得到存活的阳性细胞克隆，传代后作为抗人乳头瘤病毒药物筛选模型，分别命名为HPV1模型细胞、HPV11模型细胞；

其中，质粒pRP-Neo的定义同权利要求3中所述。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)在六孔板中培养HaCaT细胞，待细胞密度达8×10⁵-10×10⁵个/孔，用HPV1环状DNA或HPV11环状DNA与质粒pRP-Neo共转染HaCaT细胞；

(2)转染24h后，更换新鲜完全培养基继续培养24h，转染细胞经消化按1：10稀释后采用终浓度为450-550μg/mL的G418进行筛选，10-16天后，更换为不含G418的完全培养基进行细胞培养，存活的阳性细胞克隆进行传代培养；

其中，所述完全培养基为90％DMEM高糖培养基+10％FBS；

优选地，步骤(1)中HPV1环状DNA或HPV11环状DNA与质粒pRP-Neo的摩尔比为2：1-4：1。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，HPV1环状DNA、HPV11环状DNA的构建方法如下：

1)人工合成HPV1全基因组DNA，通过BamH Ⅰ位点克隆入pGS1载体，得到质粒pGS1-HPV1，将质粒pGS1-HPV1、pBR322-HPV11分别用BamH Ⅰ酶切，胶回收7.82Kb或7.93Kb条带；将胶回收线性化HPV1或HPV11采用T4连接酶进行片段自连，分别得到连接产物HPV1环状DNA、HPV11环状DNA；

2)将步骤1)所得连接产物浓缩纯化后进行酶切鉴定；

步骤1)中，酶切体系为：pGS1-HPV1、pBR322-HPV11质粒DNA 2-5μg，BamH Ⅰ1μL，10×Cutsmart buffer 5μL，ddH₂O补齐至50μL；酶切条件：37℃水浴酶切1h；

步骤1)中，连接体系为：线性化HPV1或HPV11终浓度5-10ng/μL，10×连接酶缓冲液30μL，T4连接酶终浓度0.02-0.1 Weiss Unit/μL，ddH₂O补齐至300μL；连接条件为：15-18℃水浴连接15-20h；

步骤2)中，HPV1环状DNA的酶切鉴定体系为：HPV1环状DNA 30-100ng，Kpn Ⅰ1μL，10×Mbuffer 2μL，ddH₂O补齐至20μL；

HPV11环状DNA的酶切鉴定体系为：HPV11环状DNA 30-100ng，HindⅢ 1μL，10×Mbuffer 2μL，ddH₂O补齐至20μL。