[发明专利]鉴定功能元件的方法

权利要求书

1.一种用于鉴定基因组序列功能元件方法，包括：

(a)将文库导入经改造含有Cas蛋白的细胞群中，其中所述细胞群中的每个细胞含有不超过一个指导RNA；

(b)基于细胞表型的改变将细胞分选成至少两组；

(c)确定每组中存在的指导RNA的相对表示，由此通过每个组中存在的指导RNA的表示确定与细胞表型改变相关的基因组位点；

(d)扩增被靶向的一个或多个基因的一个或多个cDNA序列用于测序；

(e)将测序读段映射到靶基因的参考序列；

(f)过滤读段以保留仅携带错义突变或框内缺失的读段；和

(g)通过生物信息学流程确定每种氨基酸或核苷酸对细胞表型的权重；

其中所述文库选自下组：

(i)用于鉴定基因组序列功能元件的文库，其包含多个CRISPR-Cas系统指导RNA，所述指导RNA包含能够靶向至少一个连续基因组区域内的多个基因组序列的指导序列，其中所述指导RNA靶向至少100个基因组序列，该基因组序列包含所述连续基因组区域内每1000个碱基对的PAM序列上游的非重叠切割位点；

(ii)根据(i)所述的文库，其中所述文库包含靶向连续基因组区域内每个PAM序列上游的基因组序列的指导RNA；

(iii)根据(i)或(ii)所述的文库，其中将每个指导RNA设计为影响DSB位点周围10bp；

(iv)根据(i)至(iii)中任一项所述的文库，其中所述PAM序列是特异性针对至少一种Cas蛋白的；

(v)、根据(i)至(iv)中任一项所述的文库，其中基于特异性针对至少一种Cas蛋白的多于一个PAM序列来选择所述CRISPR-Cas系统指导RNA；

(vi)根据(i)至(v)中任一项所述的文库，其中所述靶向导致连续基因组区域的NHEJ；

(vii)根据(i)至(vi)中任一项所述的文库，其中所述多个CRISPR-Cas系统指导RNA内的至少一个指导RNA的所述靶向导致细胞表型的改变和/或基因的转录和/或表达增加或减少；

(viii)根据(i)至(vii)中任一项所述的文库，其是质粒文库或病毒文库；或

(ix)根据(i)至(vii)中任一项所述的文库，其是载体文库或宿主细胞文库。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞表型的改变选自如下的一项或多项：细胞功能丧失、细胞功能获得、基因的转录增加、基因的表达增加、基因的转录减少、基因的表达减少。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述基因组序列为编码功能蛋白质的基因组序列。

4.根据权利要求3所述的方法，其用于以单个氨基酸分辨率鉴定所述蛋白质的功能元件。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述鉴定处于天然生物背景下。

6.根据权利要求2所述的方法，其中所述鉴定处于天然生物背景下。

7.根据权利要求3所述的方法，其中所述鉴定处于天然生物背景下。

8.根据权利要求4所述的方法，其中所述鉴定处于天然生物背景下。

9.根据权利要求1所述的方法，所述生物信息学流程包括：

(h)对于含有错义突变的片段，如下计算每个计算的突变比率：突变比率：

10.根据权利要求2所述的方法，所述生物信息学流程包括：

(h)对于含有错义突变的片段，如下计算每个计算的突变比率：突变比率：

11.根据权利要求3所述的方法，所述生物信息学流程包括：

(h)对于含有错义突变的片段，如下计算每个计算的突变比率：突变比率：