[发明专利]用于生产乙酰氨基葡萄糖的高效几丁质酶

权利要求书

1.用于生产乙酰氨基葡萄糖的高效几丁质酶，其特征在于，所述酶氨基酸序列(Chitinolyticbacter meiyuanensis,GenBank:ATN39892.1)在第266位、第270位、第342位上发生突变，由原来的T、Y、K分别突变为S、I、M，构建方法包括以下步骤：

1)从NCBI上获得几丁质酶序列(Chitinolyticbacter meiyuanensis,GenBank:ATN39892.1)，交生物公司合成，采用HindⅢ酶切pET20b(+)质粒，设计PCR引物F:GCTCGAATTCGGATCATGTCGCAAATCAATCGCT，R:GAATTAATTCGGATCTTACTTGTTCATGTTGCCCAT，PCR反应结束后，加20μl Cloning Enhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pET20b(+)质粒用HindⅢ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coli JM109，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒转化宿主E.coli BL21进行表达，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；

2)质粒DNA的提取

将携带有质粒pET20b(+)/CmChi1的E.coli BL21基因工程菌接种于LB/Amp(Amp终浓度100μg/ml)液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体操作按照说明书进行；

3)易错PCR扩增与突变文库的构建

以步骤二获得的质粒为模板，用Nco Ⅰ酶切使质粒线性化，设计引物CmChi1-F：ATTCCGATATCCATGATGTCGCAAATCAATCGCT和CmChi-R:CCGGCGATGGCCATGTTACTTGTTCATGTTGCCCAT，进行易错PCR扩增基因，易错PCR扩增体系(50μl)为10×TaKaRa Taq Buffer，dNTPs Mixture，引物各0.2μmol/L，模板DNA 200ng，Taq DNA聚合酶2.5U，PCR反应条件：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环，72℃10min，Mn²⁺浓度0.5mmol/l，Mg²⁺浓度为7.0mmol/l，加20μl Cloning Enhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pET20b(+)质粒用NcoⅠ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coli BL21，涂布于固体LB平板(100μg/ml Amp)抗性筛选阳性转化子，所有转化子构成突变体文库；

4)突变文库的高通量筛选

从LB平板上挑选单个克隆子菌落接种于含有300μl LB培养基(内含50μg/ml Amp)的96孔中，每孔对应一特定转化子，每块96孔板同时接种野生型克隆，作为阳性对照，37℃、200r/min振荡培养12h，在无菌条件下，从96孔板中取出20μl菌液，4℃临时冷藏种子于96深孔板，25℃、200r/min振荡培养重组菌48h后，以每孔一一对应为原则，移取10μl菌液，对应涂布于以几丁质为唯一碳源的选择性固体培养基，35℃培养5d后，将比对照组透明圈大的克隆挑出并进行复筛；

5)将复筛通过的阳性克隆，送生物公司测序；

6)突变体的生产，将步骤五的含有突变质粒的E.coli BL21发酵培养；

7)突变体的纯化，采用分子筛的方法纯化突变体；

8)对突变体进行SDS-PAGE电泳；

9)采用Bradford测定蛋白质浓度。

2.根据权利要求1所述的用于生产乙酰氨基葡萄糖的高效几丁质酶，其特征在于，所述酶用于提高乙酰氨基葡萄糖的生产率。