[发明专利]用于提高化妆品成分AA-2G生产转化率的酶

说明书

本发明涉及用于提高化妆品成分AA‑2G生产转化率的酶‑环糊精糖基转移酶的制备和应用，所述‑环糊精糖基转移酶氨基酸序列(Geobacillus stearothermophilus,GenBank:CAA41770.1)在第199位、第233位、第240位上发生突变，由原来的N、V、D分别突变为Y、E、A，其有意效果在于，改进的糖基转移酶生产AA‑2G的效率较野生型酶提高8.95‑11.90％。

技术领域

本发明属于基因工程与酶工程领域，具体涉及AA-2G生产用环糊精糖基转移酶的制备和应用。

背景技术

维生素C葡萄糖苷(ascorby glucoside,AA-2G)，学名2-0-α-D吡喃型葡萄糖基-L维生素C(2-0-α-D-glucopyranosy-L-ascorbic acide)是维生素C的一种衍生物，该化合物于1990年由日本林原生物化学研究所与日本冈山大学药学系共同研究发现，AA-2G是VC和吡喃型葡萄糖通过糖基转移酶作用的缩合产物，其中VC的C2羟基被吡喃型葡萄糖苷取代，两者通过糖苷键连接，由于C2上有葡萄糖基，因此AA-2G具有显著的非还原性，其同分易构体5-0-α-D吡喃型葡萄糖基-L维生素C(AA-5G)和6-0-α-D吡喃型葡萄糖基-L维生素C(AA-6G)都具有直接的还原性，虽然其比VC稳定，但不如AA-2G稳定。AA-2G具有非还原活性，不易发生氧化反应，在水溶液中稳定，具有较好的耐光型和耐热性，进入细胞后经α-葡萄糖苷酶水解生成VC和葡萄糖，具有同原始VC一样的还原性和抗氧化性，以及促进胶原蛋白的形成。

环糊精糖基转移酶(CGTase)属于糖基水解酶家族，被认为是催化合成AA-2G的最佳酶，CGTase能够催化4种反应：水解反应、环化反应、耦合反应以及歧化反应，CG Tase通过歧化作用可以催化低聚糖和VC反应生成葡萄糖基维生素C。日本林原生化和冈山大学首次以α-环糊精作为糖基供体通过生物转化法合成AA-2G，AA-2G的纯度可达97％，目前酶法合成是AA-2G合成的唯一途径。已经开发的用于合成AA-2G的酶有5种，α-葡萄糖苷酶、环糊精葡萄糖苷转移酶、α-淀粉酶、蔗糖磷酸酶、α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶，目前投入工业化生产的是环糊精葡萄糖苷转移酶，也是目前催化合成AA-2G的最佳酶，但是现有技术中CGTase还存在酶的转化率不高的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供用于提高化妆品成分AA-2G生产转化率的酶，其具有更高的转化率，更适合AA-2G的生产。

本发明的制备过程如下：

1.从NCBI上获得环糊精糖基转移酶序列(Geobacillus stearothermophilus,GenBank:CAA41770.1)，交生物公司合成，采用EcoRⅠ酶切pET20b(+)质粒，设计PCR引物F:GTGCGGCCGCAAGCTTTGATGCCTTGACACTGAGT，R:CTCCGTCGACAAGCTAAGCAGCCATAGCGTCATCA，PCR反应结束后，加20μl Cloning Enhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pET20b(+)质粒用HindⅢ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coli JM109，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒转化宿主E.coli BL21进行表达，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；

2.质粒DNA的提取

将携带有质粒pET20b(+)/cgt的E.coli BL21基因工程菌接种于LB/Amp(Amp终浓度100μg/ml)液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体操作按照说明书进行；

3.易错PCR扩增与突变文库的构建