[发明专利]具有高杂交性能的寡核苷酸缀合物及其应用

说明书

本发明提供了一种具有高杂交性能的寡核苷酸缀合物及其应用，本发明的寡核苷酸缀合物可用作核酸检测的探针，使用本发明的寡核苷酸缀合物能够更灵活的对探针进行设计，保守区域更易得。探针的特异性更好，而且能够显著提高探针的荧光值，荧光本底显著降低，探针灵敏度得到了极大的提升。

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体地说，本发明涉及具有高杂交性能的寡核苷酸缀合物及其应用。

背景技术

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光标记探针，在PCR扩增设备上选择合适的荧光通道，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，再通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。通常用的检测方法有染料法和Taqman探针法。

染料法中通常使用SYBR GREEN,SYBR GREEN等可以结合到双链DNA上的染料。当PCR反应体系中的模板进行扩增时，SYBR GREEN可以有效结合到新合成的双链上，随着PCR的进行，结合到新合成的双链上的SYBR GREEN染料越来越多，被仪器检测到的荧光信号越来越强，从而达到定量的目的。

TaqMan探针法的原理是在PCR反应体系中加入一对引物和一条特异性的荧光标记探针，该探针为一寡核苷酸序列，序列两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整且当两个基团的距离很近时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，不发荧光。扩增开始时,在95度变性条件下，双链模板解离成单链，在退火温度下，探针开始结合在DNA其中一条单链上，在PCR延伸时，耐热性TaqDNA聚合酶发挥其5’－3’端外切酶活性将探针降解，使得报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

由于染料法在PCR扩增时，染料会插入到所有的双链结构中，当实验中出现非特异扩增或引物二聚体时，会极大地影响结果的准确性。另外，染料法无法在同一个反应管中检测多个靶基因。Taqman探针法与染料法最大的区别是，探针法中的荧光信号只来源于目标序列，故不会受非特异性扩增产物及引物二聚体的影响。

Taqman探针法的设计利用的是FRET原理，即荧光能量共振转移。是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm(100埃)范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，供体的荧光被受体淬灭，即FRET现象。当供体和受体的距离大于100埃时，两种荧光分子间发生FRET的有效性会降低甚至无法进行FRET作用。所以，探针设计受到了序列长度的限制。为了增加单核苷酸基因分型的区分度以及对复杂的靶基因提供设计的灵活性，减少探针长度变得至关重要。然而，探针缩短会降低熔解温度(TM值)，在PCR循环温度下阻碍了探针与靶序列的有效结合。

因此，本领域技术人员致力于解决探针设计长度和理想的TM值之间的矛盾。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于核酸检测的探针及检测方法，尤其是一种用于实时荧光定量PCR检测的探针及检测方法。

在本发明的第一方面，提供了寡核苷酸缀合物，所述寡核苷酸缀合物结构如下式I所示：

R-N-Q-D，I

其中，R为任选地荧光基团，N为寡核苷酸单元，Q为淬灭基团，D为阳离子单元。

在另一优选例中，R为无或为荧光基团。

在另一优选例中，式I中，各“-”独立地为化学键或者接头(linker)。

在另一优选例中，式I中，各“-”独立地为磷酸二酯键。

在另一优选例中，所述寡核苷酸缀合物为PCR检测探针或引物。