[发明专利]一种人工表皮化妆品检测试剂盒的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种人工表皮化妆品检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取人皮肤组织原始样本分离获得原代皮肤细胞，所述原代皮肤细胞分别经过真皮细胞培养基和表皮细胞培养基选择性培养后可获得人皮肤成纤维细胞和人皮肤表皮细胞；

(2)将步骤(1)中获得的人皮肤成纤维细胞进行传代培养，传代到P3代，获得P3代人皮肤成纤维细胞悬液；

(3)将步骤(1)中获得的人皮肤表皮细胞进行传代培养，传代到P3代，获得P3代人皮肤表皮细胞悬液；

(4)取带聚碳酸酯膜的小室，将步骤(2)制备的P3代人皮肤成纤维细胞悬液和Ⅰ型胶原蛋白混合放入上述小室中，混合后胶原蛋白终浓度0.7-0.8mg/ml，静置后在上述小室加真皮培养基，35-37℃培养箱中培养2-3天，培养的真皮层渗液2-3次，获得装有人工皮肤真皮层的小室；

(5)将步骤(3)获得的人皮肤表皮细胞悬液加到步骤(4)获得的装有人工皮肤真皮层的小室内，静置后在小室加表皮培养基，35-37℃培养箱中培养2-3天，更换人工表皮培养基，35-37℃培养箱中再培养5-10天，培养结束加入固体保存培养基保存，封板、包装、保存。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的P3代人皮肤成纤维细胞悬液的细胞浓度40-400万/ml；步骤(3)中所述的P3代人皮肤表皮细胞悬液的细胞浓度40-1000万/ml。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的真皮培养基为含1-100μM rock inhibitor的真皮细胞培养基；上述真皮细胞培养基包含如下组分：以500ml计，250ml DMEM高糖培养基、250ml F12营养培养基混合，5-20ml B27添加剂、5-20ml PC-1添加剂、10-100μl基因重组人表皮生长因子、5ml青链霉素；

所述的表皮培养基包含如下组分：以500ml计，角质无血清培养基250ml，DMEM培养基125ml，Ham’s F-12培养基125ml，200mML-谷氨酰胺：终浓度1.5mM，牛垂体提取物：终浓度25μg/ml，表皮生长因子：终浓度0.2ng/ml，干细胞生长因子：终浓度30ng/ml，纤维母细胞生长因子1.5ng/ml，转化生长因子-β：终浓度0.8ng/ml，血管内皮生长因子：终浓度10ng/ml,100X青霉酸-链霉素：终浓度1X，0.3M氯化钙溶液：终浓度0.4mM；

所述的人工表皮培养基包含如下组分：30-60％DMEM基础培养基，30-60％F12基础培养基，0.1％-4％谷氨酰胺，0.1％-4％腺嘌呤，0.1％-4％氯化钙，0.05％-2％氢化可的松。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述的固体保存培养基为添加0.3％-0.6琼脂的人工表皮培养基。

5.按照权利要求1-4任一项所述的制备方法制备的人工表皮化妆品检测试剂盒。

6.如权利要求5所述的人工表皮化妆品检测试剂盒在检测化妆品对人皮肤效果方面的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述化妆品对人皮肤效果指化妆品对人皮肤的刺激性、腐蚀性、抗衰老性、抗氧化、美白功效。

8.如权利要求5所述的人工表皮化妆品检测试剂盒在检测化妆品对人皮肤刺激性、腐蚀性、抗衰老性、抗氧化、美白功效的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1将小室转移至新的六孔细胞培养板中，每孔外加入人工表皮培养液，置于35-37℃细胞培养箱中孵育4-18h；

S2孵育后，向孵育的小室中加入待测化妆品后室温作用3-30min，终止作用；

S3将步骤S2处理过的小室转移到新的含有人工表皮培养液的六孔细胞培养板中，置于35-37℃细胞培养箱中孵育46-50h；

S4将经过步骤S3孵育后的小室转移到新的24孔细胞培养板中，利用不同染色方法可验证化妆品对皮肤的刺激性、腐蚀性、抗衰老性、抗氧化、美白功效的效果。