[发明专利]一种食品级嗜热链球菌表达系统及其在酸奶制备中的应用

说明书

本发明公开了一种食品级嗜热链球菌表达系统及其在酸奶制备中的应用。所述食品级嗜热链球菌表达系统包含食品级宿主嗜热链球菌CH3070、食品级表达载体pST5240；所述食品级宿主嗜热链球菌CH3070是采用同源重组技术敲除嗜热链球菌JIM8232基因组上的乳糖转运酶STlacS基因而获得，丧失利用乳糖的能力；食品级表达载体pST5240包含来自于植物乳杆菌的乳糖转运酶LPlacS基因作为筛选标记，能赋予菌株代谢半乳糖的能力和更高的生物量；所述表达系统在异源蛋白表达中应用，表达效果显著；所述表达系统不含抗生素抗性筛选标记，为食品级表达系统，可以直接应用于酸奶发酵中。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种食品级嗜热链球菌表达系统及其在酸奶制备 中的应用。

背景技术

随着基因工程技术的不断提高，近年来乳酸菌分子生物学及作用机制的研究取得了重大 发展，加之不同乳酸菌菌株基因组测序的完成，为乳酸菌基因工程的发展和遗传操作体系的 构建奠定了基础。乳酸菌食品级表达系统的构建及应用已成为该领域研究的前沿和热点。“食 品级”系统的定义为：能最大限度应用于食品工业，或产生用在食品中的产物的系统。食品 级基因表达系统的基本要求如下：(1)载体必须是食品级的；(2)宿主菌为食品级且可鉴定及稳 定的微生物；(3)采用食品级选择标记；(4)采用食品级诱导物。利用食品级基因表达系统有目 的、有选择地研制新一代的微生态制剂，直接应用于食品工业和医药保健等领域，因此乳酸 菌食品级基因表达系统的研究和开发具有相当大的潜力和意义。

嗜热链球菌作为重要的乳酸菌菌株，被认为是“公认的安全级菌株”。目前广泛用于生产 一些重要的发酵乳制品，包括酸奶和奶酪。在发酵的过程中，嗜热链球菌能够产生许多活性 物质，包括胞外多糖、细菌素和维生素等。此外，多项研究已经表明，嗜热链球菌也可以作 为潜在的益生菌，进入人体之后发挥健康效果、转运活性和一定的胃肠道粘附性。因此，酸 奶作为一种传递嗜热链球菌的载体，受到人们的重视。牛奶作为发酵乳制品的原料，其中含 有大量的乳糖，嗜热链球菌编码的乳糖透过酶STlacS具有双重作用，一方面将乳糖转进胞内， 乳糖经胞内的β-半乳糖苷酶水解成葡萄糖和半乳糖，生成的半乳糖同时由乳糖透过酶STlacS 转出到胞外，造成酸奶中半乳糖的积累。

上述乳糖的不彻底分解会造成大量的半乳糖积累，这些半乳糖的存在往往会影响发酵乳 制品的品质，如造成马苏里拉奶酪、瑞士硬干酪和切达奶酪的褐变，还限制了半乳糖血症人 群对发酵乳制品的食用。

现有技术中降低嗜热链球菌发酵过程中半乳糖的积累的主要方法就是与其它菌株共培 养。中国文献《基于乳糖水解酶的乳酸乳球菌乳糖代谢多样性研究》[邓笑颖,杨宇,姜杨等,《食 品与发酵工业》,2019年第45卷第21期(总第393期)]公开了利用乳酸乳球菌与嗜热链球 菌复配时半乳糖积累现象得到明显减弱，但是该方法必须乳酸乳球菌与嗜热链球菌必须复合 使用，限制嗜热链球菌的应用。

目前已报道的嗜热链球菌食品级载体选择标记是胸苷酸合成酶基因thyA。胸苷酸合成酶 在DNA的合成中起关键作用，缺失胸苷酸合成酶基因的菌株在基本培养基中不能生长。Sasaki 等构建了以thyA基因为选择标记的食品级表达载体，用外源的α-淀粉酶(amyA)基因在营 养缺陷型的嗜热链球菌自发突变体TM1-1中测试了其表达能力，开发了一种用于嗜热链球菌 的安全食品级表达系统。但是这种系统的应用需要配制包含胸苷酸的特定培养基，增加了使 用成本。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种食品级嗜热链球菌表达系统及其在酸 奶制备中的应用，该套嗜热链球菌食品级表达系统表达效果好，系统中所有的DNA原件来 自于公认的安全的微生物，不含有抗生素筛选标记。

本发明的技术方案如下：

一株食品级宿主嗜热链球菌CH3070的构建，包括如下步骤：

(1)提取嗜热链球菌JIM8232(Streptococcus thermophilus JIM8232)的基因组DNA；