[发明专利]基于荧光传感器的单克隆抗体分泌细胞筛选方法

说明书

本发明公开一种基于荧光传感器的单克隆抗体分泌细胞筛选方法，属于生物技术、免疫分析和纳米材料应用领域。本发明构建了荧光标记多肽与纳米氧化石墨烯基于FRET的荧光传感器，将其加入杂交瘤细胞中，实现了高亲和力单克隆抗体分泌细胞的筛选。此方法只需要一步就可以筛选出高亲和力单克隆抗体分泌细胞，简化了传统筛选方法的复杂过程，具有方便快速、节约人力、物力、财力的优点。

技术领域

本发明属于生物技术和免疫分析领域，特别涉及一种基于荧光传感器的单克隆抗体分泌细胞筛选方法。

背景技术

2004年，纳米石墨烯片层被首次分离出来，并由于其独特的结构和优异的性能成为国内外学者的研究热点。纳米氧化石墨烯(Nanographene oxide，NGO)是纳米石墨烯材料经过强氧化后再分解而得，其表面含有含氧基团如羟基、烷氧基、羧基等，这些活性基团的存在使NGO在水溶液中的分散稳定性显著提高，并使其具有亲水性和生物相容性，可与多种生物分子相互作用。除此之外，最让人关注的是纳米氧化石墨烯高效的能量吸收和贮藏功能。

荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)是一项成熟灵敏的分子相互作用监测技术，是检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具。FRET是相互接近的两个荧光分子间产生能量转移的一种现象，当一个荧光基团(供体Donor)的发射光谱与另一个基团(受体Acceptor)的吸收光谱有一定重叠，在两者合适的距离下就可以观察到荧光能量由供体向受体转移的现象。纳米氧化石墨烯对能量具有高效的转移和吸收作用，当NGO与荧光分子相互靠近到纳米级间距时，将劫取荧光能量，发生快速荧光萃灭效应，而当NGO与荧光分子解离，则不发生荧光能量转移效应，荧光即可重现。因此，NGO可作为一种灵敏的荧光传感器材料，用于设计和构建基于FRET的检测技术体系。

目前，单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)在生物制药、免疫分析和生物制备中已得到广泛应用。杂交瘤技术仍然是生产制备mAb的主流方法，其基本步骤包括：1)用特定的抗原免疫动物；2)动物B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合；3)分泌单克隆抗体杂交瘤细胞筛选；4)抗体分泌细胞克隆化；5)mAb特性鉴定。其中，细胞筛选与克隆化是制备理想mAb的关键环节。即传统的单克隆抗体细胞筛选方法过程比较繁琐，有两次筛选过程，第一次是使用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；第二次就是进一步筛选出能产生我们需要的抗原特异性抗体的杂交瘤细胞。但是大量杂交瘤细胞样品需要在短时间内确认是否为抗体分泌细胞，并且要鉴定高亲和力抗体分泌细胞，以决定杂交瘤细胞的取舍。因此，必须建立方便快速和廉价的高亲和力单克隆抗体分泌细胞的筛选方法。当前，酶联免疫分析(ELISA)、单细胞显微分析和荧光细胞分选(FACS)等方法相继建立，但仍未能尽如人意，高亲和力单克隆抗体分泌细胞筛选方法一直是获得高亲和力mAb的技术瓶颈。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于荧光传感器的单克隆抗体分泌细胞筛选方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于荧光传感器的单克隆抗体分泌细胞筛选方法，包括如下步骤：

(1)将纳米氧化石墨烯(NGO)与荧光标记抗原(FAg)混合，超滤，得到NGO-FAg荧光传感器；

(2)将单克隆抗体杂交瘤细胞与步骤(2)的NGO-FAg荧光传感器混合，分选强荧光细胞，即筛选出高亲和力单克隆抗体分泌细胞。

步骤(1)中所述的荧光标记抗原是通过将异硫氰酸荧光素(FITC)标记在免疫抗原(Ag)的多肽N端得到。

所述的免疫抗原优选为硒蛋白K特定的抗原表位肽，其氨基酸序列为：MVYISNGQVLDSRNQSPWRV，分子量为2852Da。

所述的异硫氰酸荧光素的激发光波长为488nm，发射光波长为520nm。