[发明专利]一种乙酰木聚糖酯酶基因、其编码产物及制备方法

权利要求书

1.一种包含乙酰木聚糖酯酶基因的重组工程菌，其特征在于，所述乙酰木聚糖酯酶基因，命名为Est1051，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的一种包含乙酰木聚糖酯酶基因的重组工程菌，其特征在于：

所述乙酰木聚糖酯酶基因编码的乙酰木聚糖酯酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的一种包含乙酰木聚糖酯酶基因的重组工程菌，其特征在于：

所述的乙酰木聚糖酯酶基因的制备步骤如下：

(1)从样品中提取总DNA，纯化总DNA，酶切总DNA；

(2)回收步骤(1)得到的酶切后的DNA片段，将DNA片段和pUC118载体连接，得到质粒；

(3)将步骤(2)所得质粒转化、文库筛选和阳性克隆子鉴定；

(4)测序，将质粒命名为pUC118-Est1051，并设计PCR引物；

(5)以质粒pUC118-Est1051为模板，PCR扩增进行基因克隆；

(6)将PCR产物纯化，得到乙酰木聚糖酯酶基因。

4.如权利要求3所述的一种包含乙酰木聚糖酯酶基因的重组工程菌，其特征在于：

所述PCR引物是：

Est1051-F：CCGGAATTCCCCGTTGCGGTGTCATTATACTGAC

(下划线部分为EcoRⅠ的酶切位点)；

Est1051-R：CCGCTCGAGGCTCCCGAAGAACCTATGAAACCAATTG(下划线部分为XhoⅠ的酶切位点)。

5.如权利要求3所述的一种包含乙酰木聚糖酯酶基因的重组工程菌，其特征在于：

所述步骤(5)的操作是：以质粒pUC118-Est1051为模板、Est1051-F和Est1051-R为引物，采用Prime STAR^TMMax Premix进行Est1051基因片段的PCR扩增，体系如下：

PCR的反应条件是：

第一阶段：95℃变性2min；

第二阶段：95℃变性10sec，60℃退火5sec，72℃延伸5sec，共30个循环；

第三阶段：72℃延伸10min，最后于4℃保存。

6.一种应用权利要求1所述的工程菌制备乙酰木聚糖酯酶的方法，其特征在于：

把乙酰木聚糖酯酶基因与pET-28a(+)表达载体连接，获得连接产物重组质粒pET-28a(+)-Est1051，把重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中形成重组工程菌，培养重组工程菌，破碎，得到粗酶液，纯化，得到乙酰木聚糖酯酶。

7.根据权利要求6所述的制备乙酰木聚糖酯酶的方法，其特征在于：

详细操作是：把乙酰木聚糖酯酶基因与pET-28a(+)表达载体连接，获得连接产物重组质粒pET-28a(+)-Est1051，把重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中形成重组工程菌，重组工程菌接种在LB液体培养基中活化，然后把活化后菌体浓度为OD_600nm＝1.2的重组工程菌母液接种于另一LB液体培养基中，加入终浓度为0.8mM的IPTG，37℃培养10h，离心去上清，破碎，得到粗酶液，纯化，得到乙酰木聚糖酯酶。