[发明专利]制备具有梯度活性的半乳糖诱导合成启动子的方法、及其制备的启动子、应用

说明书

本发明涉及生物工程领域，具体涉及制备具有梯度活性的半乳糖诱导合成启动子的方法、及其制备的启动子、应用。本发明通过UAS序列、数量以及排列组合的改造，构建了33个诱导型合成启动子，获得了活性区间为9％～95％的启动子元件库，其中部分启动子的活性能达到Psubgt;GAL1/subgt;活性的80％以上，合成启动子在葡萄糖的泄露表达非常相似，甚至低于野生型的Psubgt;GAL1/subgt;，拓展了酿酒酵母中的强诱导型启动子。本发明采用的方法操作简单，试验周期短，易于实现。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及制备具有梯度活性的半乳糖诱导合成启动子的方法、及其制备的启动子、应用。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种常见的真核模式生物。为了提高目标合成产物的产量，往往需要精确调控合成通路中多个关键基因的表达。代谢途径涉及多个关键基因，为了使多基因表达实现动态平衡，代谢途径的启动子之间的强度差别可能达几个数量级。为了平衡代谢通路之间的关系，提高目标代谢物产量，减少对底盘菌生长的干扰，往往需要寻找强度合适的启动子对代谢网络沿途的多个基因进行精准调控。

在酿酒酵母中，半乳糖诱导启动子P_GAL是公认的活性最强的启动子，主要包括P_GAL1,P_GAL2,P_GAL7,P_GAL10，因此，它们也是构建和优化代谢途径中常用的启动子。半乳糖诱导启动子由核心启动子序列、葡萄糖抑制序列和半乳糖诱导的上游激活序列(Upstreamactivator sequences,UAS)组成。P_GAL的UAS是一段两端三个碱基保守，中间为随机碱基组成的17bp序列，即

5’-CGGNNNNNNNNNNNCCG-3’。不同P_GAL含有不同数量的UAS，并且每个UAS的序列不同，例如P_GAL1含有4个UAS。转录因子Gal4p与UAS结合，负责诱导激活作用。UAS的数量和序列都影响启动子活性。由于P_GAL受到葡萄糖抑制，半乳糖诱导的特性，其是表达具有毒性的蛋白或者酶的最佳候选启动子类型之一。然而，P_GAL数量有限，强度范围小，很难满足精准调控代谢网络的要求，所以人工合成具有活性梯度的半乳糖诱导型启动子，是控制复杂代谢通路中各个基因的精确表达亟需提供的策略。

杂合启动子是人工合成启动子的方法之一。构建杂合启动子的基础在于天然启动子的结构和功能，其可分为上游调控序列和核心启动子两部分元件，这些元件之间可以进行拆分、组合，从而获得具有新功能的合成启动子。Blazeck et al.将P_GAL1完整的UAS调控区域(-457～-148，309bp)分别融合到酵母不同启动子的核心启动子序列上，构建一系列受到半乳糖诱导的启动子，但是这些核心启动子的活性强度不同，导致其在葡萄糖为碳源条件下培养的泄露表达也不同，因此，需要花费较大的时间和精力，去筛选合适的核心启动子序列。

发明内容

为了解决上述问题提出并完成本发明。

本发明的目的是提供制备具有梯度活性的半乳糖诱导合成启动子的方法。

本发明的再一目的是提供半乳糖诱导合成启动子。

本发明的再一目的是提供上述半乳糖诱导合成启动子的应用。