[发明专利]一种分离纯化病原微生物DNA的方法

说明书

本发明公开了一种分离纯化病原微生物DNA的方法。将样品转移至离心管中，然后加入权利要求1或2所述的核酸释放与结合剂，涡旋混匀，孵育，再转移至纯化柱中，离心去除滤液，将纯化柱装回收集管中，再经洗涤和洗脱获得病原微生物DNA。本发明的专用于分离纯化病原微生物DNA的方法，该方法操作过程简便快捷，少量样本即可获得足够的DNA，且分离的DNA含量和纯度高。

技术领域：

本发明属于DNA提取领域，具体涉及一种分离纯化病原微生物DNA的方法。

背景技术：

近十年来在分子检测领域中，高通量测序技术发展迅猛，其一次可以对几百万到十亿条DNA分子进行并行测序，这使得其可对一个物种的转录组和基因组进行深入、细致、全貌的分析。高通量测序技术的独特优势，不仅推进了科学研究的进展，而且在临床医学领域也展现出很大的应用价值。

然而对人或者动物样本中低量感染的病原微生物进行测序时，面临着这样一个问题：由于感染样本中病原微生物的载量是非常少的，所以需要对感染样本进行超高深度的测序，才能获得低载量的所感染的病原微生物的信息。超高深度测序本身，会导致测序数据量大、测序成本高，且给数据的分析甚至是存储都带来极大不便。这个问题反过来又限制了高通量测序在临床感染诊断中的应用。所以，对人或动物样本中所感染的微生物进行抽提测序时，样本中的病原微生物得到有效的富集是非常关键的。

目前富集病原微生物核酸的技术，有过滤法、密度梯度离心法、磁珠吸附技术等。

过滤法富集微生物是将适当孔径的滤膜放入滤器过滤样品，由于滤膜的作用而将微生物滞留在与样本溶液分开，达到微生物富集的目的。该方法主要用于体液等大体积样本微生物的富集，不适用于具有一定粘稠度的样本，并且后续样本的处理比如病原微生物核酸提取较繁琐，易造成样本的损失。

密度梯度离心法是用一定的介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度将样本置于介质的顶部，根据微生物在密度梯度液中的比重不同通过离心力的作用使靶细菌分离，该方法成本昂贵，实验过程较繁琐，可处理的样本种类、体积有限，且难以实现不同种类微生物的富集与分离。

磁珠吸附技术是将临床液体样本(尿液、胸腹水、脑脊液、肺泡灌洗液等)中细菌、真菌或病毒特异性结合于磁珠上，无需高速离心，从而实现病原体的富集；再将剩余的待测样本进行核酸的提取和高通量测序。该方法所用试剂耗材成本昂贵，且耗时较长，无法满足临床标本检验的需求。

发明内容：

本发明的目的是提供一种专用于富集分离病原微生物DNA的试剂盒与方法，该试剂盒中的核酸释放与结合剂经过特殊优化，可从送检标本中有效富集病原微生物，且本核酸释放与结合剂能释放多种病原微生物DNA，无需更换其他试剂盒。核酸释放与结合剂同时具备保存、释放、结合的功能，常温下即可保存样本，释放核酸，并对释放出的DNA进行结合，省时省力，大大提高了工作效率。该方法操作过程简便快捷，少量样本即可获得足够的DNA，且分离的DNA含量和纯度高。

本发明的能释放多种病原微生物DNA，无需更换其他试剂盒的核酸释放与结合剂，包括2M～4M GuSCN、15％～17％V/V的乙醇、1％～3％V/V的Triton X100、8mM～11mM EDTA、3mM～6mM Tri-HCl、质量分数0.3％～0.6％SDS，溶剂为水。该核酸释放与结合剂同时具备保存、释放、结合的功能，常温下即可保存样本，释放核酸，并对释放出的DNA进行结合，省时省力，大大提高了工作效率。

优选，所述的核酸释放与结合剂包括3M GuSCN、16.7％V/V乙醇、2％V/V TritonX100、10mM EDTA、5mM Tri-HCl、质量分数0.5％SDS，溶剂为水。

本发明的第二个目的是提供一种分离纯化病原微生物DNA的试剂盒，其包括上述核酸释放与结合剂、洗涤液1和洗涤液2；