[发明专利]一种双途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及构建方法

说明书

本发明公开了一种双途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及构建方法，属于遗传工程领域。本发明通过将N‑乙酰神经氨酸合酶和N‑乙酰神经氨酸醛缩酶同时整合到基因组上表达，并选取3个不同强度启动子对NeuB和NanA基因进行表达量优化，最终产量在摇瓶中达到了8.3g/L，为进一步提高枯草芽孢杆菌N‑乙酰神经氨酸产量奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种双途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及构建方法，属于遗传工程领域。

背景技术

N-乙酰神经氨酸是一种功能性单糖，广泛存在于微生物以及哺乳动物体内。在人体中，N-乙酰神经氨酸参与细胞识别、信号转导等多个生理过程。因此，N-乙酰神经氨酸被广泛应用于增强婴儿免疫力，促进婴儿大脑发育。目前，N-乙酰神经氨酸主要采取天然产物提取法(鸡蛋、燕窝等)，存在其他产物难以分离，且成本较高；另外可以通过全细胞转化的方法获得，但是需要成本较高的底物乙酰氨基葡萄糖和丙酮酸为底物，由于底物转化率较低，导致神经氨酸生产成本较高。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此以枯草芽孢杆菌为宿主，通过代谢工程改造，以葡萄糖等廉价碳源为底物，高效从头合成神经氨酸是一种有效的策略。

目前在枯草中构建的N-乙酰神经氨酸代谢途径主要通过N-乙酰氨基葡萄糖为前体的NeuB关键酶合成途径，由于枯草芽孢杆菌胞内磷酸烯醇式丙酮酸(NeuB合成神经氨酸的前体物质)浓度较低，限制了神经氨酸的合成效率。这个问题的存在严重限制了神经氨酸产量的提高，进一步限制了其市场应用。

发明内容

为解决上述问题，本申请在强化NeuB为特征酶的途径基础上，进一步引入N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NanA)，其以丙酮酸为前体物质，并选取3个不同强度启动子优化NeuB和NanA表达水平，以获得N-乙酰神经氨酸产量提高的菌株。

本发明的第一个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌，通过不同强度的启动子整合表达了N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)和N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NanA)，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～5任一所示。

在一种实施方式中，N-乙酰神经氨酸合酶(NeuB)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NanA)的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

在一种实施方式中，P1启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

在一种实施方式中，P2启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

在一种实施方式中，P3启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

在一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌还过表达氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶(Gna1)和N-乙酰氨基葡萄糖异构酶(Age)。

在一种实施方式中，所述氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶(Gna1)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述N-乙酰氨基葡萄糖异构酶(Age)的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌是以P1启动子表达氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶，并以P2启动子表达N-乙酰氨基葡萄糖异构酶。

在一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌是以P1启动子表达氨基葡萄糖-6-磷酸-N-乙酰基转移酶，并以P2启动子表达N-乙酰氨基葡萄糖异构酶，并以P1启动子表达N-乙酰神经氨酸合酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶。