[发明专利]一种用于检测EGFR基因甲基化的试剂盒及方法

权利要求书

1.一种基于焦磷酸测序技术检测EGFR基因的3个CpG位点甲基化水平的引物在制备肿瘤EGFR酪氨酸激酶选择性抑制剂吉非替尼药物敏感性分析试剂中的应用，其特征在于：所述引物包括EGFR基因甲基化测序引物EGFR-mS，该测序引物与EGFR基因测序片段相匹配，测序引物的序列如下所示：

EGFR-mS：5’-GATAAGATTTGAAGGATTTT -3’；

所述EGFR基因的3个CpG位点为efgr-561、efgr-553、efgr-550，3个CpG位点的参考序列位置为NG_007726 4440、NG_007726 4448、NG_007726 4450；

所述肿瘤选自非小细胞肺癌、结肠癌、肝癌或乳腺癌。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述测序引物EGFR-mS对应的测序程序编辑为：5’-TTYGGATTTTAGAGTATTATTTYGGAYGTTTGGTATTTTTGTYGYGYGGGTAYGGYGA -3’。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述EGFR基因测序片段采用EGFR基因特异性扩增引物EGFR-mF和EGFR-mR扩增得到，扩增引物的序列如下所示：

EGFR-mF：5’- GTTTGATAAGATTTGAAGGATT -3’

EGFR-mR：5’- TACCAACTTTAAACAAACTAACCG -3’。

4.一种基于焦磷酸测序技术检测EGFR基因的3个CpG位点甲基化水平的试剂盒在制备肿瘤EGFR酪氨酸激酶选择性抑制剂吉非替尼药物敏感性分析试剂中的应用，其特征在于：该试剂盒包括EGFR基因特异性扩增引物和EGFR基因甲基化测序引物；

所述测序引物的序列如下所示：

EGFR-mS：5’-GATAAGATTTGAAGGATTTT -3’

所述扩增引物的序列如下所示：

EGFR-mF：5’- GTTTGATAAGATTTGAAGGATT -3’

EGFR-mR：5’- TACCAACTTTAAACAAACTAACCG -3’；

所述EGFR基因的3个CpG位点为efgr-561、efgr-553、efgr-550，3个CpG位点的参考序列位置为NG_007726 4440、NG_007726 4448、NG_007726 4450；

所述肿瘤选自非小细胞肺癌、结肠癌、肝癌或乳腺癌。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述试剂盒还包括样本DNA提取及DNA重亚硫酸盐转化试剂、扩增EGFR基因测序片段的试剂和焦磷酸测序试剂。

6.根据权利要求1或4所述的应用，其特征在于：检测EGFR基因甲基化的方法，包括以下步骤：

1）提取样本中的DNA；

2）对提取的DNA进行重亚硫酸盐转化；

3）以经步骤2）处理过的DNA为模板，使用EGFR基因特异性扩增引物EGFR-mF和EGFR-mR进行PCR扩增：

EGFR-mF：5’- GTTTGATAAGATTTGAAGGATT -3’

EGFR-mR：5’- TACCAACTTTAAACAAACTAACCG -3’；

4）使用以下的EGFR基因甲基化测序引物EGFR-mS对步骤3）得到的扩增产物进行焦磷酸测序，从而获得EGFR基因测序片段中CpG位点的甲基化状态：

EGFR-mS：5’-GATAAGATTTGAAGGATTTT -3’。