[发明专利]一种NK细胞培养用的饲养细胞去增殖能力的处理方法

说明书

本发明提供一种NK细胞培养用的饲养细胞去增殖能力的处理方法，是使用丝裂霉素C处理饲养细胞。本发明对饲养细胞的去增殖操作方法，成本低，操作简单，方便推广使用；本发明处理的饲养细胞细胞形态保持完整，能够更好的刺激NK细胞扩增，使其制备得到的NK细胞，具有很高的纯度和杀伤活性，经检测培养至14天时，NK细胞纯度达94％以上，扩增倍数达720以上；当效靶比为5:1时，NK细胞对K562细胞的杀伤活性为60％以上；本发明处理的饲养细胞在培养第4天的时候几乎全被NK细胞杀伤，没有后期残留，可以在临床研究中应用和推广。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种NK细胞培养用的饲养细胞去增殖能力的处理方法。

背景技术

NK细胞属于非特异性免疫细胞，它们无需抗原预先致敏，就可以直接杀伤某些肿瘤和病毒感染的靶细胞，还可以分泌多种细胞因子和趋化因子参与免疫调节。因此在机体抗肿瘤和早期抗病毒或胞内寄生菌感染的免疫过程中起重要作用。NK免疫细胞治疗在抗病毒，抗肿瘤的治疗中有着广泛的应用前景。近些年，临床上将NK细胞用于免疫治疗的例子在不断增多。

目前，采用基因重组的饲养细胞如稳定表达41BBBL和膜表达IL-21因子的K562细胞(41BBL-mbIL-21-K562细胞)被广泛用于体外NK细胞扩增，可以获得大量高纯度的NK细胞。但采用饲养细胞方法刺激NK细胞扩增，需要对饲养细胞进行灭活或去增殖处理，从而防止培养中外来细胞系的污染。灭活或去增殖的常规处理方法有两种，一是γ射线或Co60放射灭活，二是细胞反复冻融的方法。其中射线能彻底灭活，但是对仪器设备要求高，试验成本高，同时射线灭活后形态有别于处理前；而反复冻融的方法对试验仪器要求低，但灭活不彻底，需要反复多次操作，细胞形态不完整，从而影响刺激NK细胞的扩增效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种NK细胞培养用的饲养细胞去增殖能力的处理方法，本发明处理方法获得的饲养细胞刺激PBMC中NK细胞的扩增，可以获得大量高杀伤活性的NK细胞，培养过程简单，完全可以满足临床需要。

本发明首先提供一种NK细胞培养用的饲养细胞去增殖能力的处理方法，是使用丝裂霉素C(MMC)处理饲养细胞；

用于NK细胞培养的饲养细胞都可以采用本发明的方法进行去增殖处理，本发明实施例中所提供的饲养细胞为K562细胞；

所述的方法，其中丝裂霉素C是溶解于DMSO中；

更进一步的，所述的方法，处理饲养细胞时丝裂霉素C的终浓度为5-40μg/ml，其中优化处理终浓度为33μg/ml。

本发明再一个方面提供一种用于NK细胞培养用的饲养细胞，所述的饲养细胞是使用丝裂霉素C进行了去增殖能力处理；

所提供的饲养细胞用于NK细胞的培养增殖；

本发明再一个方面还提供一种NK细胞的培养方法，是使用上述的丝裂霉素C处理的饲养细胞。

本发明具有以下优势：(1)本发明对饲养细胞的去增殖操作方法，成本低，操作简单，方便推广使用；(2)本发明处理的饲养细胞细胞形态保持完整，能够更好的刺激NK细胞扩增，使其制备得到的NK细胞，具有很高的纯度和杀伤活性，经检测培养至14天时，NK细胞纯度达94％以上，扩增倍数达720以上；当效靶比为5:1时，NK细胞对K562细胞的杀伤活性为60％以上；(3)本发明处理的饲养细胞在培养第4天的时候几乎全被NK细胞杀伤，没有后期残留，可以在临床研究中应用和推广。

附图说明

图1：培养期间饲养细胞存活比例图；

图2：丝裂霉素C处理前后饲养细胞镜下细胞形态图；

图3：不同处理方法的饲养细胞刺激NK细胞扩增情况图；