[发明专利]一种构建赤点石斑鱼神经坏死病毒反向遗传系统的方法有效
| 申请号： | 202010239788.7 | 申请日： | 2020-03-30 |
| 公开（公告）号： | CN111471710B | 公开（公告）日： | 2022-03-08 |
| 发明（设计）人： | 涂加钢;张永安 | 申请（专利权）人： | 华中农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N7/00;C12R1/93 |
| 代理公司： | 武汉宇晨专利事务所(普通合伙) 42001 | 代理人： | 江丽丽 |
| 地址： | 430070 湖*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 构建 石斑鱼 神经 坏死 病毒 反向 遗传 系统 方法 | ||
1.一种构建赤点石斑鱼神经坏死病毒RGNNV反向遗传系统的方法，其特征在于，以CMV为启动子构建含RGNNV基因组的真核表达质粒，采用人胚肾293T细胞-条纹月鳢细胞SSN-1组合的方式拯救RGNNV，包括以下步骤：
1）提取RGNNV的RNA并反转录成cDNA，PCR扩增RGNNV基因组的RNA1和RNA2基因，将RNA1和RNA2基因分别连接到质粒载体的锤头状核酶HamRz序列和丁型肝炎核酶HdvRz序列之间，所述的质粒载体含CMV启动子 ；
2）将构建的含RGNNV基因组的真核表达质粒共转染293T细胞，拯救RGNNV；
3）收集转染后的293T细胞，冻融后离心取上清，转接条纹月鳢细胞SSN-1，拯救的RGNNV在SSN-1细胞中大量增殖。
2.根据权利要求1所述的构建赤点石斑鱼神经坏死病毒RGNNV反向遗传系统的方法，其特征在于，所述的含CMV启动子的质粒载体是pcDNA-Ham-BamHI-Hdv，该质粒载体是通过将HamRz-BamHI-HdvRz片段连接到质粒载体pcDNA3.1(+)得到。
3.根据权利要求2所述的构建赤点石斑鱼神经坏死病毒RGNNV反向遗传系统的方法，其特征在于，采用下述方法构建含RGNNV基因组的真核表达质粒：将RGNNV感染SSN-1细胞的样品提取总RNA并反转录为cDNA，分别扩增RNA1基因和RNA2基因，回收扩增基因；将载体pcDNA-Ham-BamHI-Hdv用BamHI酶切线性化并回收，将RNA1和RNA2两个基因通过同源重组的方法分别连接到质粒载体pcDNA-Ham-BamHI-Hdv，得到的质粒命名为pcDNA-RNA1和pcDNA-RNA2。
4.根据权利要求3所述的构建RGNNV反向遗传系统的方法，其特征在于，RNA1基因的扩增引物如SEQ ID NO.1和2所示，RNA2基因的扩增引物如SEQ ID NO.3和4所示。
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