[发明专利]一种NK细胞冻存液

说明书

本发明提供了一种NK细胞冻存液，是不使用DMSO和胎牛血清FBS；而是在细胞培养基中添加葡萄聚糖和多聚赖氨酸CPLL制成的。本发明的冻存液不包括动物或人源血清，防止了人畜共患传染病的潜在传播或引起同种异体反应的风险；加入的葡聚糖和CPLL不仅能减少冻存和复苏过程中冰晶对细胞的损伤，还能有效的保持细胞杀伤活性，使冻存复苏后细胞的功能状态持平，冻存效果好；本发明冻存液制备简单，安全，可用于临床细胞治疗的冻存，有很好的应用市场。相对于现有生物冷冻保护剂的冻存液，本发明只添加葡萄聚糖，CPLL和基础培养基，成分简单，且可以用于NK细胞的冻存。

技术领域

本发明属于细胞冻存技术领域，具体涉及一种NK细胞冻存液。

背景技术

NK细胞(Natural killer cells)是人体防御肿瘤的第一道防线，在固有免疫系统具有重要的作用，不需要提前致敏就可以对肿瘤细胞进行直接杀伤。虽然现在NK细胞已经被用于肿瘤免疫的细胞治疗，并在临床治疗肿瘤(如白血病，淋巴瘤和黑色素瘤)有很好的效果；但不论对第三方细胞库，还是对配送和应用临床管理来说，NK细胞的长期有效储存始终是一个问题。

低温贮藏技术是通过在超低温(-198℃的液氮中)冷冻保存活细胞，降低细胞的代谢速度，调节和控制细胞生长代谢的各种酶的活性受到抑制，使细胞内在的生化反应十分缓慢，甚至停止生长，从而保持细胞活性延长细胞保存年限。现有的细胞冻存液基本都是由细胞基础培养基(如DMEM，RPMI1640等)、胎牛血清(FBS)和二甲基亚砜(DMSO)制备的。其中二甲基亚砜DMSO(dimethyl sulfoxide)的作用是作为冷冻保护剂来保护细胞在冷冻和复苏的过程中免受损伤。DMSO属于渗透性保护剂，它能快速渗入细胞内，减少细胞暴露在有害环境的时间。但是DMSO在常温下对细胞有毒性作用。即使在复苏的过程中移除了绝大部分，但微量级的剩余也会对人体产生副作用(神经毒性，心血管衰竭，呼吸停止和致命的心率衰竭)。有文献报道，使用DMSO冻存的NK细胞在复苏后，其活性和功能性杀伤活力有所退化。此外，胎牛血清FBS会增加动物病原污染的机率，这都会给细胞以后的使用增加不确定因素。因此，用一种可以替代DMSO的冷冻保护剂及胎牛血清的无毒生物相容冷冻保护剂作为NK细胞冻存液就具有重要的意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种NK细胞冻存液，从而解决现有细胞冻存液使用DMSO和胎牛血清FBS而导致的问题。

本发明的NK细胞冻存液，是不使用DMSO和胎牛血清FBS；而是在细胞培养基中添加葡萄聚糖和多聚赖氨酸CPLL制成的；

所述的细胞培养基为细胞培养用基础培养基，为RPMI1640、DMEM、α-MEM、DMEM/F12等；

所述的葡萄聚糖在基础培养基中的添加的质量体积比为2～10％；优选为5％；

多聚赖氨酸CPLL在基础培养基中的添加的体积比为5～10％；优选为7.5％；

本发明还提供一种冻存NK细胞的方法，使用上述的冻存液来冻存NK细胞，其所冻存的NK细胞的浓度为5×10⁵～1×10⁸cells/ml。

本发明的冻存液不包括动物或人源血清，防止了人畜共患传染病的潜在传播或引起同种异体反应的风险；加入的葡聚糖和CPLL不仅能减少冻存和复苏过程中冰晶对细胞的损伤，还能有效的保持细胞杀伤活性，使冻存复苏后细胞的功能状态持平，冻存效果好；本发明冻存液制备简单，安全，可用于临床细胞治疗的冻存，有很好的应用市场。相对于现有生物冷冻保护剂的冻存液，本发明只添加葡萄聚糖，CPLL和基础培养基，成分简单，且可以用于NK细胞的冻存。

附图说明

图1：不同冻存液对NK细胞活性影响；

图2：冻存前NK细胞形态图；