[发明专利]抗病原高免卵黄抗体及基于AAV载体疫苗制备的方法和制剂

权利要求书

1.基于AAV载体疫苗制备抗病原高免卵黄抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

从病原的基因组序列中，选取出含有抗原蛋白片段的第一基因序列，并通过家鸡密码子优化合成相应的病原保护性抗原基因；

通过双酶切AAV载体疫苗的核心质粒pAAV-CMV-eGFP，获得载体片段；以所述抗原基因的抗原蛋白扩增引物，扩增获得两端含有双酶切位点的第二基因序列，再次双酶切所述第二基因序列，回收后分别与所述载体片段转染，获得到携带抗原蛋白的重组AAV载体疫苗；

选用健康的产蛋母鸡，将所述重组AAV载体疫苗多点接种于鸡胸部肌肉，免疫后收集其鸡卵；

利用所述鸡卵的卵黄液制备针对所述病原的抗病原高免卵黄抗体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病原为新冠病毒，获取病原保护性抗原基因的步骤具体为：

从新冠病毒的基因组序列中，选取含有RBD结构域的刺突糖蛋白S1片段基因序列，通过家鸡密码子优化合成相应的病原保护性抗原基因。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，获得携带抗原蛋白的重组AAV载体疫苗的步骤具体为：

将所述核心质粒pAAV-CMV-eGFP用EcoRI及BamHI进行双酶切，回收获得载体片段AAV-CMV；

分别设计刺突糖蛋白S1及RBD的抗原基因的扩增引物，以新冠病毒的S1基因片段为模板，扩增获得两端含有EcoRI及BamHI酶切位点的S1抗原基因片段和RBD抗原基因片段，再用EcoRI及BamHI进行双酶切回收后，与载体片段AAV-CMV连接并转化DH5α感受态，获得第一核心质粒pAAV-CMV-S1及第二核心质粒pAAV-CMV-RBD；

无内毒素提取所述第一核心质粒pAAV-CMV-S1及第二核心质粒pAAV-CMV-RBD，并分别与两个辅助质粒，按照摩尔比1：1：1的比例，用阳离子转染试剂PEI共转染HEK293T细胞；

收取所述转染HEK293T细胞，反复冻融多次后收集上清液，并加入核酸酶孵育；

孵育后再次收集上清液，去除杂质蛋白及杂质，获得所述重组AAV载体疫苗rAAV-S1和rAAV-RBD。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，免疫收集鸡卵的步骤具体为：

选用健康的母鸡，按照1E+11vg/只剂量，将所述重组AAV载体疫苗rAAV-S1和rAAV-RBD多点接种于鸡胸部肌肉，免疫后收集其鸡卵；

对所述鸡卵的蛋壳消毒，蛋壳严重污染的，事先选出进行单独消毒，用清水冲洗干净后与净蛋一同浸入水温42℃的0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15min，随后浸入90-95℃水浴中消毒5秒钟，快速取出后晾干，4℃环境下保存。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用硫酸铵沉淀法获得所述卵黄抗体，具体步骤为：

用去离子水7倍稀释所述卵黄，再用3mL浓度为0.1mol/L的HCl溶液，调节pH值至5.2后，4℃环境下静置6h，12000r/min离心30min，过滤取上清液；

各取2mL上清液3份，加入饱和硫酸铵溶液至其终浓度分别为40％，60％，80％，4℃环境下过夜后，5000r/min离心25min，弃去上清液，将沉淀物分别以2mL的纯水复溶。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用聚乙二醇沉淀法获得所述卵黄抗体，具体步骤为：

在所述卵黄中加入20mL的Tris-HCL缓冲液中，所述Tris-HCL缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH值为7.6，混合均匀后加入PEG至其浓度W/V为3.5％并充分混合，8000r/min离心25min；

取上清液再加入PEG至其终浓度W/V为12％并充分混合，12000r/min离心10min，弃去上清液；

将沉淀物用10mL的1×PBS溶液复溶，再加入PEG至终浓度W/V为12％，充分混合，12000r/min离心10min，弃去上清液，将沉淀物用2mL的PBS溶液复溶。