[发明专利]一种同时测定人工虎骨粉中胱氨酸和甲硫氨酸含量的方法

说明书

本发明一种同时测定人工虎骨粉中胱氨酸和甲硫氨酸含量的方法，包括以下步骤：(1)取人工虎骨粉样品，加入过甲酸溶液氧化，加入氢溴酸终止氧化，蒸干，加入盐酸水解，蒸干，用衍生缓冲液溶解，衍生得供试品溶液；(2)分别取磺基丙氨酸和蛋氨酸砜对照品，用衍生缓冲液溶解，衍生得混合对照品溶液；(3)分别将供试品溶液和对照品溶液进行色谱检测，色谱柱以氰基键合硅胶为填充剂；柱温20度；流动相：A为乙酸钠缓冲液；B为甲醇‑乙腈‑水，进行梯度洗脱；(4)根据检测结果计算得到人工虎骨粉中磺基丙氨酸和蛋氨酸砜的含量，进而计算得到其胱氨酸和蛋氨酸砜的含量。本发明检测方法准确可靠，简便快速。

技术领域

本发明属于中药检测技术领域，涉及一种同时测定人工虎骨粉中胱氨酸和甲硫氨酸含量的方法。

背景技术

人工虎骨粉是一种健骨药物，是新一代虎骨代替品，具有强筋骨、祛风湿、止痛等功效，临床主要用于骨质疏松症、骨折、类风湿关节炎、慢性腰腿痛等骨关节疾病的治疗。人工虎骨粉所含成分与天然虎骨基本相同，研究表明，其药理、药效及安全性指标与天然虎骨无明显差异，国家药品监督管理局国家药品标准YBZ01602003-2009Z-2019颁布了人工虎骨粉的质量控制标准，该质量控制方法仅控制了人体需要的十六种氨基酸的含量，并未对甲硫氨酸和蛋氨酸的含量进行控制。而甲硫氨酸和蛋氨酸均为人体需要的氨基酸，与其它十六种氨基酸具有相同的活性，在增强人体免疫力、促进骨骼生长发育以及维持人体的正常机能方面均起着重要作用。

因此，准确测定人工虎骨粉中胱氨酸和甲硫氨酸的含量对评价其内在质量具有重要意义。

虽然，现有技术中，对于胱氨酸和甲硫氨酸已经有一些检测方法，但是，现有的检测方法大多为检测类似奶粉、饲料等胱氨酸、甲硫氨酸含量较高的物品中胱氨酸和甲硫氨酸的含量，其提取和检测均较为简单(干扰因素少)。

而人工虎骨粉为动物的骨骼所组成，质地坚硬，胱氨酸、甲硫氨酸的提取难度大，且其含量较小，不易检测(干扰因素多)。甲硫氨酸、胱氨酸现有的检测方法采用的色谱柱为普通C₁₈柱，柱温为30℃、35℃及40℃，流动相为以乙酸钠缓冲溶液(称取3.56g无水乙酸钠，溶于1000ml水中，加入体积分数为0.1％三乙胺，用冰醋酸调节pH为6.4)为流动相A，以乙腈-水(50:50)为流动相B，进行不同梯度试验，该色谱条件无法准确的对人工虎骨粉中甲硫氨酸和胱氨酸进行定量(色谱图中甲硫氨酸和胱氨酸色谱峰与其它杂质峰无法进行有效的分离)；因此，并不能直接将现有的测定方法用于人工虎骨粉中胱氨酸和甲硫氨酸的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时测定人工虎骨粉中胱氨酸和甲硫氨酸含量的方法，可对人工虎骨粉中胱氨酸和甲硫氨酸进行准确的检测，从而为人工虎骨粉的质量标准提升和临床应用提供依据。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种同时测定人工虎骨粉中胱氨酸和甲硫氨酸含量的方法，包括以下步骤：

S1、供试品溶液制备：

取人工虎骨粉样品，加入过甲酸溶液进行氧化反应，再加入氢溴酸终止氧化反应，所得反应液蒸干得到残渣1，将残渣1加入盐酸中进行水解，水解产物蒸干得残渣2，将残渣2用衍生缓冲液溶解后过滤，取续滤液加入衍生试剂进行衍生反应，得供试品溶液；

S2、混合对照品溶液制备：

分别取磺基丙氨酸和蛋氨酸砜对照品，用衍生缓冲液溶解后过滤，取续滤液加入衍生试剂进行衍生反应，得混合对照品溶液；

S3、分别将供试品溶液和混合对照品溶液注入高效液相色谱仪进行色谱检测，分别得到供试品溶液和混合对照品溶液的色谱数据；其中，色谱检测条件如下：色谱柱以氰基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温为20℃，按照体积百分比计，流动相包括97％～0％的流动相A和3～100％的流动相B；流动相A为乙酸钠缓冲液；流动相B为甲醇-乙腈-水混合液；