[发明专利]17β-羟基类固醇羟化酶3突变酶及编码基因及工程菌

说明书

本发明公开了17β‑羟基类固醇羟化酶3突变酶及编码基因及工程菌，17β‑羟基类固醇羟化酶3突变酶简写为17β‑HSD3^G186R/Y195W，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明采用理性设计技术对17β‑羟基类固醇羟化酶3进行分子改造，经多同源建模、分子对接、结合能计算等方法而获得与底物亲和力提高的17β‑羟基类固醇羟化酶3突变酶，酶活提高为原来的1.66倍，利用此策略可以显著提高17β‑羟基类固醇羟化酶3的催化活力。本发明的编码17β‑羟基类固醇羟化酶3突变酶使睾酮产量高达3.95g/L，为规模化的生物法制备睾酮这种雄性激素类药物提供技术支撑和数据参考。

技术领域

本发明属于酶工程和生物工程技术领域，具体涉及一种17β-羟基类固醇羟化酶3突变酶及编码基因及含有编码基因的质粒及工程菌。

技术背景

类固醇类药物被广泛用作抗炎、利尿、合成代谢、避孕药、雄激素、孕激素和抗癌药物，因此它们是制药行业的一种非常宝贵的资源，每年全球市场超过1000亿美元，睾酮(TS)就是其中一种十分重要的雄性激素。睾酮作为一类调节男性生育力、肌肉质量和脂肪分布的关键性激素，临床上用于治疗男性性腺功能减退，维持男性第二性征以及性功能等；同时睾酮也是一种非常有用的类固醇前体，通常用于合成高性能类固醇药物，如5α-二氢睾酮，其对男性生殖器官的正常发育至关重要。医药行业对睾酮日益增长的需求，导致睾酮市场一直处于供不应求的状态。为了从甾醇中获得睾酮，研究人员已经提出多种方法：(1)通过多步化学合成；(2)酶法催化4-雄烯-3,17-二酮(4-AD)制备睾酮；但是，这两种睾酮生产技术都面临着瓶颈问题：

传统化学合成工艺中，睾酮主要是以4-雄烯-3,17-二酮(4-AD)、1,4-雄二烯-3,17-二酮(ADD)或甾醇为原料，通过多步化学法进行合成的，但是由于前体物质甾核上不饱和化学键较多，因而造成化学合成过程副产物多、转化率低等现象，且化学合成方法成本高、污染大，随着环保意识的不断提高和绿色技术的进一步发展，无毒无污染的生物技术必然成为睾酮工业化生产的主要方向。

微生物合成工艺中，睾酮合成的前体物是4-AD，微生物胞内的17β-羟基类固醇羟化酶(17β-HSDs)可以将4-AD的C17-酮基催化还原成羟基，用于睾酮的合成。但是微生物来源的17β-羟基类固醇羟化酶存在以下问题：①该来源17β-羟基类固醇羟化酶是一类可逆的氧化还原酶，催化甾核上C17-酮基和C17-醇基之间进行可逆性还原/氧化反应，不适于睾酮高效率制备；②在催化4-AD转化为睾酮的过程中，会伴随着一些C19类固醇的副产物产生，如ADD和1(2)-脱氢睾酮(1(2)-DT)，从而导致睾酮的积累量极低，无法满足工业生产要求。

人体中17β-羟基类固醇羟化酶3(17β-HSD3，NADPH依赖型的17-氧化还原酶)是人体诸多17β-HSDs亚型中的一种，主要存在于男性睾丸间质细胞的微粒体中，作为睾酮合成的关键酶，能够特异性识别4-AD上C17的酮基，并在辅因子NADPH的作用下，专一、不可逆地催化4-AD合成睾酮。Baillie等检测出睾丸中睾酮的含量是4-AD的10倍左右。

有人选择人源的17β-羟基类固醇羟化酶3(17β-HSD3)酶法催化4-AD合成睾酮，如图1所示，然而该酶活性低、表达量少、反应需酶量大，导致睾酮酶法催化成本高昂，不利于规模化制备。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种酶活性提高，使睾酮酶法催化成本下降，利于规模化生产的17β-羟基类固醇羟化酶3突变酶。

本发明的第二个目的是提供一种编码上述17β-羟基类固醇羟化酶3突变酶的基因。

本发明的第三个目的是提供一种含有上述基因的重组质粒。

本发明的第四个目的是提供一种含有上述质粒的工程菌。

本发明技术方案概述如下：