[发明专利]一种检测和定量单拷贝染色体外DNA或RNA的方法

说明书

本发明提供了一种准确、有效、稳定可行的检测细胞中染色体外基因序列和病毒基因的单拷贝数量和部位的方法，所述方法包括如下步骤：(1)在靶细胞的染色体中期相或细胞涂片上，利用三个一级探针与目标基因序列杂交结合；(2)利用二级探针进行杂交结合；所述二级探针为可与三个上述一级探针中的紧邻的两个一级探针序列特异性结合的核酸序列；(3)加入扩增探针，与二级探针相结合；(4)将与扩增探针相结合的标记探针进行杂交结合；(5)于荧光显微镜下进行镜检。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测和定量单拷贝染色体外DNA或RNA的方法。

背景技术

肿瘤是由原癌基因激活或者抑癌基因功能丢失引发的。最近的研究发现，大量的与癌症相关的基因并不在染色体上，而是会从染色体上脱落下来，变成一种大小为几百Kb到Mb不等的小型环状的 DNA，而被称为染色体外DNA(extrachromosomal DNA，ecDNA)。染色体外DNA广泛存在于肿瘤细胞中，它们的拷贝数往往比较高，相应基因的RNA拷贝数也可能较高，而且随着细胞复制或药物治疗会发生动态变化，染色体外DNA有望成为肿瘤异质性的重要标志物，也可能成为肿瘤基因治疗和耐药性的重要标志物。

染色体外DNA不仅存在于血液中，也被发现在其他体液包括胸腔积液中。染色体外DNA不仅和肿瘤相关，还可能是真核细胞内的一种应对危机的基因扩增机制，所以染色体外DNA也有可能存在于其他一些应对危机出现的细胞中，其重要性和应用途径也许非常广泛。

传统的染色体核型加染色体外DNA的分析法，在没有抓住中期分裂相的细胞中，基本上检测不到染色体外DNA，在少量的循环肿瘤细胞中分析的可能性更加渺茫。DNA显微镜技术，由于单拷贝DNA/RNA的检测信号不够强，不能满足DNA数量和位置的精准要求。病毒感染的细胞中的病毒RNA或病毒DNA的原位检测，也遇到同样的问题。

因此，本领域急需一种准确、有效、简单可行的检测细胞中染色体外DNA和RNA的单拷贝数量和部位的精准检测方法。

发明内容

针对现有技术的不足和市场需求，本发明的目的在于提供一种准确、有效、简单可行的检测细胞中染色体外基因序列的单拷贝数量和部位的方法。为了实现该目的，本发明提供的方法的步骤包括：

(1)在靶细胞的染色体中期相或细胞涂片上，利用三个一级探针与目标基因序列杂交结合；每个所述一级探针为与目标基因中部分核酸序列配对结合的核酸序列；所述目标基因序列包括DNA或 RNA序列片段；

(2)利用二级探针与步骤(1)所得物的一级探针的配对序列进行杂交结合；所述二级探针为可与三个上述一级探针中的紧邻的两个一级探针的配对序列特异性结合的核酸序列；

(3)向步骤(2)所得物加入扩增探针与二级探针相结合；所述扩增探针为生物素标记了的核酸探针；

(4)将与扩增探针特异性结合的标记探针(如亲和素蛋白质) 加入，并使之相结合；

(5)于荧光显微镜下进行镜检。

在步骤(1)当中，本发明通过与目标基因片段对应的三个一级探针结合，建立四个基因信号扩增点，从而使目标片段的特异性信号得以扩增，而非特异性结合信号不能扩增。

本发明通过一级探针修饰释放出结合位点，建立比邻杂交后探针的架桥和扩增点，然后通过步骤(3)的信号扩增处理和步骤 (4)的信号标记处理，之后便可以通过显微镜进行观察检测。