[发明专利]酮还原酶、核酸、重组表达质粒及菌株、合成劳拉替尼中间体中的应用

权利要求书

1.一种酮还原酶，为如下的(a)、(b)或(c)：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽；

(b)在(a)基础上突变n个氨基酸、缺失或添加m个氨基酸的具有(a)活性的多肽；其中，1≤n≤10，1≤m≤30；

(c)与(a)具有至少90％同一性且具有(a)活性的多肽。

2.编码权利要求1所述酮还原酶的核酸，其DNA序列如SEQ ID NO:1所示。

3.包含权利要求2所述核酸的重组表达质粒。

4.根据权利要求3所述的重组表达质粒，其中，所述核酸选用pET21a载体构建重组表达质粒。

5.包含权利要求3或4所述重组表达质粒的重组表达菌株。

6.根据权利要求5所述的重组表达菌株，其制备方法包括以下步骤：

1)将所述重组表达质粒转化到宿主细胞，涂布在含有50μg/mL氨苄的LB平板上，37℃过夜培养后，从中挑选阳性菌落接种到50mL液体LB培养基中进行培养；培养4h后，吸取10mL种子液转入1L新鲜的LB液体培养基；

2)当培养的浓度达到OD₆₀₀ 0.6-1.0时，加入终浓度为0.05-1.0mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷进行诱导，诱导温度为16-30℃，诱导培养为8-16h，诱导培养后离心或浓缩，得到重组表达菌株的湿菌体。

7.根据权利要求6所述的重组表达菌株，其中，所述宿主细胞为大肠杆菌E.coliBL21。

8.权利要求1所述酮还原酶在合成(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述合成的方法为：在纯水相体系下，在pH 6.0-8.0的缓冲液中，在葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和辅酶存在下，所述酮还原酶对前体羰基化合物进行不对称还原反应形成(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇，所述前体羰基化合物为2-碘-5氟苯乙酮，所述辅酶为NADP辅酶。

10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述方法包括以下步骤：

1)将权利要求6或7所述重组表达菌株的湿菌体破碎，得到酮还原酶的粗酶裂解液；

2)在缓冲液中加入粗酶裂解液、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖、辅酶以及前体羰基化合物，在25-35℃温度下反应，用碳酸钠控制pH，用TLC点板检测反应完全；

3)过滤除蛋白，用等体积乙酸乙酯萃取水相和洗涤滤饼两次；

4)合并有机相，减压回收溶剂，即得(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇；

所述粗酶裂解液的用量为5000-20000U/L；所述前体羰基化合物在反应液中的浓度为50-200g/L；所述葡萄糖脱氢酶的用量为5000-20000U/L；所述葡萄糖的用量为80-300g/L；所述辅酶的用量为0.1-0.5g/L。