[发明专利]改进牛卵母细胞体外成熟的方法

权利要求书

1.牛卵母细胞体外成熟的方法，该方法包括如下步骤：

(1)提供卵母细胞，其是照包括如下步骤的牛活体采卵方法采集得到的：

i、取卵前的超排处理

筛选两侧卵巢上直径2~8mm的卵泡数≥20的牛，作为卵母细胞供体牛，牛龄为2~5岁；在两天内分4次等剂量注射FSH制剂进行超排，每次注射间隔12h，每次注射剂量以FSH计为0.5μg/kg牛体重；

ii、活体采卵

在末次注射FSH制剂48小时后，进行活体采卵，活体采卵操作如下：

(ii1)术前准备：调试设备至工作状态，收集管中注入5ml吸卵液，置衡温器中，衡温器温度调至39℃；用透明塑料导管连接取卵针针尾和收集管塞上的一个接口，收集管塞的另一接口与真空泵相连；动物站立稳定，清除直肠粪便，消毒外阴，用2-4ml的20%利多卡因进行尾间隙硬膜外腔神经干传导阻断麻醉，待尾根松软后进行操作；

(ii2)卵巢及卵泡的观察：操作人员一手握住B超探头柄部，将其轻缓插入阴道穹隆处，另一手伸入直肠，从直肠握住卵巢，将其置于探头上，移动卵巢，通过B超屏幕观察卵巢的结构和大小，区分卵泡和黄体，详细记录卵泡的数目和大小；在B超屏幕上，卵巢呈弱回声结构，轮廓清晰；卵泡在卵巢区域内呈多个无回声区，轮廓清楚，可以进行采卵；

(ii3)取卵：移动卵巢使将要穿刺的卵泡位于B超显示屏取卵线上，吸卵针内吸满吸卵液，将其插入探头背部的穿刺针固定筒中，针头刺破阴道壁和卵泡壁，同时，用脚踏开关控制真空泵，吸取卵泡内容物至收集管中；重复穿刺几个卵泡后，及时抽出穿刺针，从针头吸入适量的吸卵液冲洗针管，以防被凝固的血液堵塞，冲洗液一同收至收集管中，得到卵泡液；

iii、卵母细胞的检出

将采集的卵泡液立即用洗卵液稀释，倒入胚胎滤器中，反复洗涤3-4次，最后将滤器中的液体及沉淀物倒入培养皿中，在解剖镜下检出采集的卵母细胞数，并计数具有如下性状的作为可用卵母细胞的卵母细胞数目即可用卵数：卵母细胞的细胞质均匀、COCs包裹有不少于两层卵丘细胞，至少有5层以上颗粒细胞，且致密地排列于卵母细胞周围；(2)卵母细胞的体外成熟：使所述卵母细胞移入成熟培养液滴中，进行体外成熟培养，培养条件为100%湿度、38.5°C、5%CO2，体外成熟培养22~24h；

其中，

所述成熟培养液的组成为：20mg/L辛酸钠、5mg/L聚乙烯醇、10%发情牛血清、26.2mmol/L的NaHCO3、10µmol/L的EGCG、5mmol/L的Hepe、1µg/mL雌二醇、3%牛卵泡液、10µg/mL黄体生成素、100µmol/L半胱氨酸、10µg/mL卵泡刺激素、TCM-199加至100%。

2.根据权利要求1的方法，其中步骤(ii1)术前准备中，调试设备至工作状态，吸卵真空泵的压力为50-90mmHg。

3.根据权利要求1的方法，其中牛活体采卵方法中所用的FSH制剂组成为：卵泡刺激素35μg/ml、雌三醇、0.4mg/ml泊洛沙姆188；其中卵泡刺激素：雌三醇=100：15。

4.根据权利要求1的方法，供体牛为中国黄牛。

5.根据权利要求1的方法，其中发情牛血清是照包括如下步骤的方法制备得到的：采血品种为雌性牛，选择处于发情状态的个体，进行颈静脉采血，用50mL灭菌的一次性离心管倾斜30~45°沿管壁收集；在采血当地常温静置，待观察到血样凝固后可以送回实验室，避免阳光照射，室温静置4~6h，可以观察到分层，上层析出部分血清，避免晃动；12h后离心并收集血清；血清被置于56°C水浴中灭活30min，用一次性15mL离心管根据每次用量分装；每次使用解冻一小管，避免反复冻融，造成血清质量下降。

6.根据权利要求1的方法，其中牛卵泡液是照包括如下步骤的方法制备得到的：取屠宰的牛卵巢，用手术剪剪去卵巢周围其他的组织，卵巢用酒精清洗一遍，再用生理盐水清洗2~3遍，抽取卵泡液；接着快速离心卵泡液数十秒，吸取上层清亮的卵泡液，过滤除菌，根据每次用量进行分装，-80°C冰箱冻存卵泡液；每次使用解冻适量，避免反复冻融。