[发明专利]一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的夹心ELISA定量检测法

说明书

本发明涉及一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法及其应用。本发明基于硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)包被板，通过反应条件的优化，建立了猪圆环病毒2型(porcine type 2，PCV2)病毒样颗粒(VLPs)定量的夹心ELISA方法(PCV2 VLPs HS‑ELISA)。该方法利用PCV2 VLPs作为标准品建立了用于定量的标准曲线，检测最低浓度约62.5ng/ml，相关系数Rsupgt;2/supgt;为0.998，具有操作简单、定量准确性好、灵敏度高等特点，可用于PCV2 VLPs的夹心ELISA快速定量及组装效率评价。

技术领域

本发明涉及一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法及其应用，属于动物疾病诊断和生物制品领域。

背景技术

猪圆环病毒（Porcine type 2，PCV2）是一种无囊膜的单链环状DNA病毒，属于圆环病毒科，被认为是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wastingsyndrome, PMWS）、猪皮炎肾病综合征等的主要病原体，PCV2能损伤猪免疫系统，引起猪严重的免疫抑制，常与其他病原体（猪蓝耳病毒、猪细小病毒、猪链球菌等）多重感染和混合感染，给养猪业造成重大经济损失。PCV2呈现全球性分布，PCV2感染猪的典型临床症状为体表皮肤出现丘疹或者不规则的红紫斑、精神不振等，在保育猪中，最常见的是呼吸道综合征，引起生长缓慢、厌食等不良情况。在妊娠期的母猪中，主要引起繁殖性障碍，产生死胎或者流产等情况。在部分临床案例中，PCV2的感染不产生明显症状。

疫苗是防御PCV2 感染的最有效手段之一，目前市场上销售的病毒样颗粒亚单位疫苗主要品牌有勃林格殷翰、普莱柯和武汉中博等，其主要抗原为PCV2 Cap蛋白或基于PCV2 Cap组装形成的PCV2病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs），能够具有很好的保护效果。然而在VLPs疫苗的生产和质量控制过程中，对于有效抗原的定量方式非常重要。目前在对PCV2 VLPs及Cap蛋白的鉴定及定量方式主要包括透射电子显微镜、分子筛色谱法、间接免疫荧光、超速离心法和夹心ELISA法等。

目前PCV2夹心ELISA的公开专利（猪圆环病毒2型双抗体夹心ELISA试剂盒及其应用，申请号201811095919.8）以及（识别PCV2病毒样颗粒的单克隆抗体及其在定性及定量检测PCV2病毒样颗粒中的应用，申请号201811261025.1）中都是基于将制备的鼠源单克隆抗体包被在96孔板中，建立双抗夹心ELISA方法，这些方法的技术关键是利用小鼠杂交瘤细胞技术筛选出合适的鼠源单抗，整个过程技术要求高、周期长。硫酸乙酰肝素（HeparanSulfate，HS）是PCV2 细胞受体。Misinzo G. 等报道PCV2或PCV2 VLPs可通过与细胞表面硫酸乙酰肝素（Heparan sulfate, HS）或者硫酸软骨素B（Chondroitin Sulfate B, CS-B）结合而侵染细胞（Misinzo G, Delputte PL, Meerts P, Lefebvre DJ, and Nauwynck HJ.Porcine circovirus 2 uses heparan sulfate and chondroitin sulfate Bglycosaminoglycans as receptors for its attachment to host cells. Journal ofvirology 2006;80 (7): 3487-3494.）。减少以上受体分子在细胞膜上的分布，将会明显抑制PCV2 的侵染。因此本发明将HS包被到96孔板，建立PCV2 VLPs夹心ELISA方法，缩短了新型夹心ELISA方法的研发周期，此法适用于PCV2 VLPs夹心ELISA快速定量及组装效率评价。

发明内容