[发明专利]一种使用分子筛离心柱的方法获取动物组织RFPs的方法

说明书

本发明提供一种使用分子筛离心柱的方法获取动物组织RFPs的方法，包括以下步骤：对动物组织进行除血、冷冻和研磨等预处理，然后细胞裂解液进行裂解，得到预处理物；将预处理物进行分阶段高速离心处理，收集上清液；将上清液加入到预处理的分子筛离心柱，然后低速离心，得到初提物RNC；在初提物RNC中加入核酸酶进行酶切，然后加入反应中止试剂和RNA提取试剂，得到动物组织RFPs。本发明所述的方法得到的动物组织RFPs，特别是动物心脏组织中的RFPs，较其它提取方法，可节省大量提取时间，并且其中可用有效数据质量高，核糖体占比低，可排除因无效数据对心血管疾病在翻译组学方面的研究上的干扰。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种使用分子筛离心柱的方法获取动物组织RFPs的方法。

背景技术

翻译组学，连接着转录组和蛋白质组，是生物信息学层次传递过程中的一个重要枢纽。翻译并不是简单的对基因表达信息进行传递，而是在传递的过程中对有效信息进行广泛而精细的重新调控，是幅度最大的调控步骤，对蛋白的折叠，蛋白的定位、功能以及产量均起到至关重要的作用。对该方面的研究，也越来越引起同行业的科学家和专家日益的重视。2009年，Weissman课题组首次提出ribosomal profiling（Ribo-seq）技术。从此，Ribo-seq技术逐渐在科研领域占据重要位置。Ribo-seq技术主要采用二代测序技术检测被核糖体的保护的约22-30bp的RNA小片段，也称之为Ribosome footprints(RFPs)。通常针对Ribosome profiling进行研究的方法中，基本都是对组织或者细胞进行裂解，酶切去除非核糖体富集的游离mRNA后，采用蔗糖密度梯度离心分离单核糖体，再根据不用实验要求采用不同去核糖体RNA的方法后再安排进行测序。

然而，在Ribo-seq技术应用的过程中一直存在着操作复杂、仪器要求高、耗时长、效果不佳等诸多问题。在组织或者细胞进行前期裂解处理过程中，核糖核酸酶（RNase）的浓度和时间不加以控制，会出现酶切过度或者不足的情况，并且不同条件下的酶切条件难以统一，导致最终测序结果无效，甚至无法继续完成研究。此外，在采用蔗糖密度梯度离心中，需要贵重仪器如超高速离心机，不仅成本增加，而且操作十分繁琐。此外，在蔗糖密度梯度离心的操作过程中，蔗糖溶液无法灭菌而造成RNase的污染，而且离心过程常存在杂质污染，最终导致样本核酸的降解，回收率低。除此之外，在最终使用去rRNA操作中，去除rRNA的探针通常是针对完整rRNA设计而成，而酶切之后，切断的rRNA无法与探针进行有效结合而导致rRNA的除去效率低下。这些Ribo-seq技术应用的难题，大大地阻碍Riboseq技术在实验室和商业应用上的发展。

为了摸索Riboseq技术在心脏组织提取rRNA过程中的特性，我们根据之前对动物（小鼠）不同组织样本的RIBO-seq测序实验中发现，采用传统蔗糖密度梯度离心法后进行去核糖体rRNA后，心脏组织测序数据中，核糖体rRNA占比仍然非常高（60%-80%），有效数据大为减少。而心脏作为人体机能的中心枢纽，心脏组织中蛋白表达异常丰富，这些蛋白的表达也同样受到翻译的调控作用。翻译调控方式的改变，进而会影响其蛋白含量和功能的变化，进一步造成心梗、心衰以及心肌肥大等心血管方面的疾病。因此，能否快速完整获取动物心脏组织中RFPs并测定其中的含量和变化，是对了解心血管疾病的发生、发展以及治疗作用的重要前提；而Riboseq技术存在的技术难题（核糖体rRNA占比仍然非常高），导致无法将Riboseq技术所得实验数据进行心血管方面的疾病的判定。

我们在追踪Riboseq技术中RFPs的主要提取方法的研究进展时，发现其还是参照常规的方法，进行动物组织裂解后，使用非特异性核酸酶去除非核糖体覆盖的游离mRNA后，采用蔗糖密度梯度离心法进行提取，但在提取过程中仍然未克服对高仪器要求、高成本、易污染、操作繁琐等技术难题，且根据其前期的研究数据中发现，该方法对动物心脏组织RFPs的提取易燃存在数据质量低，核糖体占比高的情况，对心血管疾病在翻译组学方面的研究起到干扰作用。

因此，有必要提供改进的技术方案以克服现有技术中存在的技术问题。