[发明专利]一种简便RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒开发及应用

说明书

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于检测RNA结合蛋白免疫沉淀的试剂盒和使用该试剂盒检测RNA结合蛋白免疫沉淀方法。该试剂盒包括TBST缓冲液、RIPA裂解液、Protein G/A磁珠、RNase抑制剂。所述TBST缓冲液包括：20mM Tris‑HCl、500mM NaCl、0.05％Tween 20(pH7.5)；所述RIPA裂解液包括：50mM Tris‑HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、1％NP‑40、0.1％SDS；所述Protein G/A磁珠为Protein G/A琼脂糖珠。使用本发明的试剂盒进行RNA结合蛋白检测方法操作简单，成本低，效率高，适合大规模推广使用，能够为科研人员节省大量的时间和经费。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于检测RNA结合蛋白免疫沉淀的试剂盒和使用该试剂盒检测RNA结合蛋白免疫沉淀的方法。

背景技术

RNA结合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)，是一类与RNA分子直接相互作用的蛋白质，RBP是代谢中的关键部件，它能参与到RNA转录后修饰的各个层面，例如RNA外显子的拼接、多聚腺苷化作用、从核质到亚细胞的转运、细胞内定位、翻译、降解和退化等。细胞内RNA的并非独立存在，而是以更具功能性的核糖核蛋白复合物(RNP)的形式存在。RNP是RBP由与编码或非编码蛋白的结合形成的功能单元。RBP不管是在时间和空间上都能与RNA稳定地结合。

基因表达的调控在生物体内细胞的生长、分化和应激反应等方面都起着重要的作用。但除通过转录因子对转录过程进行调控之外，细胞的转录后调控也在生理过程中起着重要的作用，其中包括通过RNA结合蛋白对mRNA转录速度进行特异性和快速的调控。RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecipitating，RIP)是一种基于抗原抗体反应，通过免疫共沉淀的方法研究体内与RNA结合蛋白特异性结合的RNA转录本之间关系的技术。

RIP技术是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助发现非编码RNA的调节靶点。RIP技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析。RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用，但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物，RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同(如复合物不需要固定，RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶，抗体需经RIP实验验证等等)。RIP技术下游结合microarray技术被称为RIP-Chip，帮助更高通量地了解癌症以及其它疾病整体水平的RNA变化。

95％的人类基因组并不编码基因，而是产生大量的非编码RNA,真正编码蛋白质的基因只占人类总基因组的约2％。这些非编码RNA在生命的生长发育的各个阶段都发挥着重要的调节作用，与艾滋病、白血病、糖尿病、畸形等多种病变密切相关，并且参与着干细胞和表观遗传学调控。而RNA-蛋白复合物驱动了几乎所有细胞过程的基因表达的转录后调控，包括剪接(splicing)、出核转运(nuclear export)、mRNA稳定性以及蛋白转译过程，因此，对基因调控的了解就有赖于确定这些过程中RNA的结合的变化。因此，RNA研究也被越来越多的科学家重视起来，目前已经成为生命科学研究中一个炙手可热的领域，而RIP技术也逐渐成为RNA研究领域的一项常规方法，有助于了解越来越受关注的转录后调控网络。目前RIP实验多采用试剂盒方法操作，但是实验成本很高，(目前国外可检测12例标本的试剂盒约8000元左右)大大增加了研究人员的经济负担。因此，研制开发一种可快速、准确检测检测RNA结合蛋白方法一直是亟待解决的新课题。

发明内容

针对上述问题，本发明根据免疫学原理结合分子生物学实验技术提供一种用于检测RNA结合蛋白免疫沉淀的试剂盒使用该试剂盒检测RNA结合蛋白免疫沉淀的方法，本发明提供的试剂盒克服现有RIP试剂盒成本过高，步骤繁琐的不足。使实验成本大大降低，并且该试剂盒经验证对多种基因，多种细胞检测效果好，和现有同类试剂盒相比较有很大的优势。