[发明专利]一种改进的胃癌冷冻组织开放染色质检测方法

权利要求书

1.一种改进的胃癌冷冻组织开放染色质检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.将胃癌冷冻组织加入Stable buffer中研磨，将重悬后的样品过70μm滤膜，再次研磨，过40μm滤膜收集滤液，离心去上清，加入Stable buffer混匀，随后分别按顺序加入不同浓度50％、30％、40％碘克沙醇溶液梯度离心，得到含细胞核的滤液；所述Sable buffer包含以下终浓度的各组分：5mM CaCl₂，3mM Mg(Ac)₂，10mM Tris pH7.8，0.1mM EDTA，0.10％NP40，320mM蔗糖，0.02mM PMSF蛋白酶抑制剂，0.2mMβ-巯基乙醇；

S2.取步骤S1含细胞核的滤液，加入Restable Buffer-Tween稀释，然后对滤液中的细胞核进行计数，挑取50,000细胞核，离心去上清，向沉淀中加入转座体系，进行转座反应；然后对已转座的DNA进行纯化，再进行PCR扩增，最后将PCR产物纯化后进行测序；所述Restable Buffer-Tween包含以下终浓度的各组分：10mM Tris-HCl pH 7.4，10mM NaCl，3mM MgCl₂，0.10％Tween 20。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1所述胃癌冷冻组织与Stablebuffer的质量体积比为10～20mg：1～2mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1所述梯度离心溶液为先加入50％碘克沙醇溶液，重悬混匀，使终浓度为25％，再将30％碘克沙醇溶液加至25％的溶液层之下，最后将40％碘克沙醇溶液加至30％的溶液层之下，离心。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2所述含细胞核的滤液与RestableBuffer-Tween的体积比为2：5～6。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2所述转座体系为25μL TD buffer，2.5μL DDW，2.5μL TDE1，16.5μL PBS，0.5μL 1％digitonin，0.5μL 10％Tween-20。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2所述转座反应为1000rpm，37℃，30min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2所述对已转座的DNA进行纯化为用AMPure beads进行纯化：向已转座的DNA中加入AMpure beads，混匀后静置，再置于磁分离架上静置分离，然后去除上清并用80％乙醇溶液洗涤，重复该步骤，去除残留的乙醇溶液，最后用EB溶液或DDW洗脱。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2所述PCR产物纯化为用AMPurebeads进行纯化：向PCR反应产物中加入终浓度为0.65×的AMpure beads，混匀后静置，再置于磁分离架上静置分离，将上清液转到新管中，加入终浓度为1.8×的AMpure beads，混匀后静置，再置于磁分离架上静置分离，然后去除上清并用80％乙醇溶液洗涤，重复该步骤，去除残留的乙醇溶液，最后用EB溶液或DDW洗脱。

9.权利要求1～8任一项所述方法在胃癌冷冻组织开放染色质检测中的应用。

10.一种用于胃癌冷冻组织开放染色质检测的产品，其特征在于，包含权利要求1中所述的Stable buffer，不同浓度碘克沙醇溶液及Restable Buffer-Tween。