[发明专利]一种抗犬基质金属蛋白酶的杂交瘤细胞株及其制备方法和一种单克隆抗体及其应用

说明书

本发明涉及一种抗犬基质金属蛋白酶13(MMP‑13)的杂交瘤细胞株及其制备方法和一种单克隆抗体及其应用。该杂交瘤细胞株保藏号为CCTCC NO:C2019290，其分类命名为抗犬MMP‑13杂交瘤细胞株8C7，其中抗犬MMP‑13的杂交瘤细胞株通过以下方法获得：(1)采用PET‑28a(+)表达载体在IPTG的诱导下表达免疫原，以该免疫原免疫BALB/c小鼠；(2)用免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合；(3)经筛选获得分泌抗犬MMP‑13单克隆抗体的杂交瘤细胞。本发明采用Ni‑NTA‑sefinose层析柱纯化得到了高纯度的犬MMP‑13抗原，保证后续阳性克隆的筛选和抗体的产生，确立了间接ELISA法快速测定单抗的产生与效价，通过接种BALB/c雌性小鼠腹腔获取了大量单抗，该抗体具有特异性强、纯度高、均一性好等优点，在检测MMP‑13的免疫印迹方法(western blot)和免疫荧光方法中的应用效果良好。

技术领域

本发明属于生物技术-单克隆抗体领域，具体涉及一种抗犬基质金属蛋白酶的杂交瘤细胞株及其制备方法和一种单克隆抗体及其应用。

背景技术

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是一种包含锌元素的钙离子依赖蛋白酶类，能够降解细胞外基质(extracelluar matrix，ECM)中所包含的大部分成分。迄今为止发现20多种基质金属蛋白酶，根据其分子量大小及底物的不同可以将其分为胶原酶(collagenases)，明胶酶(gelatinases)、间质溶素 (stromelysins)，膜型基质金属蛋白酶(membrane-type MMP，MT-MMP) 和其他类型基质金属蛋白酶。基质金属蛋白酶家族包括5个共同的结构域：信号肽和前肽、催化结构域和血红素结合蛋白样C末端结构域，后者通过铰链区和催化结构域。MMPs活性依赖于锌离子(Zn²⁺)，其催化结构域有2个Zn²⁺结合区和1个钙离子(Ca²⁺)结合区，2个Zn²⁺结合区中分别为催化性结合区，位于MMPs酶活性中心内，通过保守序列HEXGHXXGXXH中氨基酸与Zn²⁺结合，参与MMPs催化过程；另一个为结构性结合区。翻译产物经信号肽引导质胞浆内质网。其中MMP 13 又称胶原酶3，它的水解底物为Ⅰ、Ⅱ型胶原。

研究报道，金属蛋白酶家族在维持软骨细胞外基质合成和降解动态平衡中发挥重要作用，基质金属蛋白酶13(Matrix metalloproteinases,MMP-13)，可降解软骨组织中特有的Ⅱ型胶原蛋白，造成软骨细胞外基质降解异常。

骨软骨病(osteochondrosis，OC)是动物和人类生长软骨中最常见的一种疾病。在动物中，已有犬、猪、马、牛、鸡以及火鸡等报道这种疾病。OC被认为是造成猪“弱腿症”的重要原因，同时也是青年马和犬跛行的常见原因。

剥脱性骨软骨炎(osteochondritis dissecans)是在1888年由德国外科医生提出的，用于描述与人类患者关节中碎片形成相关的疾病。该术语后来被改为剥脱性骨软骨病(osteochondrosis dissecans,OCD)，因为认识到炎症不是原发性病变的特征。在马中，同时诊断出OCD和滑膜炎时，仍称为剥脱性骨软骨炎。在人类中，也使用“剥脱性骨软骨炎”，青少年和成人的发病形式也得到了确认，与动物OCD发病最相似的是青少年OCD。

OCD是“骨软骨病”潜在的疾病过程的结果。骨软骨病是生长板软骨和/或骺生长软骨软骨内骨化过程发生局灶性紊乱的一种病理状态，以关节变形、运动性共济失调和跛行为特征。

软骨内成骨发生在生长软骨内，生长软骨是一种最终被犬骨软骨病发生直接原因是软骨细胞赖以生存的细胞外基质(糖胺聚糖和胶原蛋白)降解异常。因此，MMP-13是反映关节软骨降解的特殊标记，对早期骨软骨病的发生具有重要的临床诊断意义。