[发明专利]从湖羊乳中定向筛选益生菌菌种的方法

权利要求书

1.一种从湖羊乳中定向筛选益生菌菌种的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)MRS培养基微生物的分离及菌种鉴定；(2)湖羊奶微生物基因组测序及抗菌肽基因引物设计；(3)抗菌定向筛选；(4)病原菌拮抗性检验；(5)细菌疏水性筛选；(6)细菌自凝集和共凝集筛选；(7)细菌耐热、耐酸、耐碱筛选；(8)细菌胃肠道模拟筛选；(9)抗生素敏感检验。

2.如权利要求1所述的一种从湖羊乳中定向筛选益生菌菌种的方法，其特征在于所述步骤(1)MRS培养基分离微生物及菌种鉴定方法如下：(a)采用MRS培养基培养法从湖羊乳样品中分离筛选目的菌株；(b)用通用引物对分离出的菌株进行DNA提取、PCR扩增和测序；(c)根据其16srRNA基因序列构建系统发育树进行菌种鉴定。

3.如权利要求1所述的一种从湖羊乳中定向筛选益生菌菌种的方法，其特征在于所述步骤(2)湖羊奶微生物基因组测序及抗菌肽基因引物设计方法如下：(a)采集健康湖羊乳样品，提取样品中的微生物菌群基因组，并进行高通量测序；(b)对高通量测序的数据进行组装；(c)筛选大于10kb的组装序列，通过搜索antisMASH数据库预测基因组中抗菌肽基因并设计特异性引物：

4.如权利要求1所述的一种从湖羊乳中定向筛选益生菌菌种的方法，其特征在于所述步骤(3)抗菌定向筛选是利用步骤(2)设计的引物对MRS培养基筛选出的菌株进行菌落PCR二次筛选，筛选出潜在的能分泌抗菌素的微生物菌株。

5.如权利要求1所述的一种从湖羊乳中定向筛选益生菌菌种的方法，其特征在于所述步骤(4)病原菌拮抗性检验方法如下：在37℃的MRS培养基中培养待测菌株12小时，在LB培养基中培养病原菌，用LB液体培养基稀释病原菌200倍，用病原菌悬液浸透LB琼脂平板，室温孵育20分钟；待LB琼脂板干燥后，用6mm深、5mm直径的无菌铁管在每个琼脂板上制备5个孔；每孔中加入30μl待测菌液，另孔中加入30μl MRS肉汤作为阴性对照；将培养板在37℃的有氧条件下培养24小时；培养后，用长度计测量抑制区ZOI，并重复实验三次。

6.如权利要求1所述的一种从湖羊乳中定向筛选益生菌菌种的方法，其特征在于所述步骤(5)细菌疏水性筛选方法如下：待测菌株细胞悬液在4℃下6000×g离心10min，用PBS洗涤两次，再用PBS悬浮，光密度OD 600nm为0.8；之后将1ml正十二烷、二甲苯或氯仿添加到3ml细菌细胞悬浮液中，漩涡振荡120s，然后静置20min以分离有机物和水相；然后去除有机相，以PBS为对照，在600nm处测定水相的吸光度A_t，重复试验三次；疏水率表示如下：

疏水性/％＝[(A₀-A_t)/A₀]×100％

其中，A₀表示混合前的OD₆₀₀；A_t表示混合后的OD₆₀₀；细菌疏水性分为低0％-29％、中30％-59％、高60％-100％。