[发明专利]高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种oxyR基因，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的oxyR基因，其特征在于，所述oxyR基因来源于希瓦氏菌株WP3Δ4RE。

3.根据权利要求2所述的oxyR基因，其特征在于，所述oxyR基因中负责响应H₂O₂的序列片段如SEQ ID NO:6所示。

4.一种高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株，其特征在于，所述突变菌株通过包括如下步骤的方法制得：以希瓦氏菌株WP3Δ4RE为出发菌株，敲除所述oxyR基因中负责响应H₂O₂的序列片段，相应获得基因突变菌株ΔoxyRc；所述基因突变菌株ΔoxyRc即为高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株。

5.根据权利要求4所述的希瓦氏菌WP3突变菌株，其特征在于，所述oxyR基因如权利要求1～3任一项所述，和/或所述被敲除的负责响应H₂O₂的序列片段如权利要求3所述。

6.权利要求4或5所述高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)根据权利要求1～3任一项所述oxyR基因设计基因敲除引物；和

(2)以所述希瓦氏菌株WP3Δ4RE为出发菌株，敲除所述oxyR基因中负责响应H₂O₂的序列片段，相应获得基因突变菌株ΔoxyRc，所述基因突变菌株ΔoxyRc即为权利要求4或5所述高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株。

7.根据权利要求6所述希瓦氏菌WP3突变菌株的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述引物包括上游引物如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示、下游引物如SEQ ID NO:4和SEQID NO:5所示。

8.根据权利要求6所述希瓦氏菌WP3突变菌株的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述敲除包括如下步骤：

(a)PCR扩增所述oxyR基因所敲除片段上下游同源臂，通过融合PCR获得大片段；

(b)连接所述大片段与自杀质粒得重组质粒，将所述重组质粒转化到供体菌E.coliWM3064；

(c)供体菌E.coli WM3064与受体菌WP3Δ4RE进行细菌接合转移；

(d)单交换克隆子及双交换克隆子的筛选、测序鉴定，得到基因突变菌株ΔoxyRc。

9.根据权利要求8所述希瓦氏菌WP3突变菌株的构建方法，其特征在于，所述自杀质粒为pRE112质粒。

10.根据权利要求8所述希瓦氏菌WP3突变菌株的构建方法，其特征在于，步骤(d)中，所述鉴定具体指设计如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的引物进行PCR扩增和测序鉴定。

11.权利要求1～3任一项所述oxyR基因、权利要求4或5所述高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株在纺织、造纸、食品和医药领域提高低温过氧化氢酶产量中的应用。

12.权利要求4或5所述高产低温过氧化氢酶的希瓦氏菌WP3突变菌株发酵生产低温过氧化氢酶的方法，其特征在于，包括步骤：

(ⅰ)将所述基因突变菌株ΔoxyRc接种至液体培养基中活化培养至对数中后期；和

(ⅱ)以对数中后期1％的接种量转接至发酵培养基中振荡发酵培养12～36h。

13.根据权利要求12所述发酵生产低温过氧化氢酶的方法，其特征在于，所述发酵培养时间为24h，和/或

所述发酵培养基内含有0.5mM的FeCl₃。