[发明专利]一种RPA-EC日本血吸虫检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开一种RPA‑EC日本血吸虫检测试剂盒，包括：多通道传感电极阵列，所述多通道传感电极阵列的每个通道包括工作电极、对电极以及参比电极，所述工作电极表面固定有RPA探针，所述RPA探针为可扩增SjR2基因片段的氨基修饰的RPA探针，所述RPA探针通过与所述工作电极表面的键合作用固定于所述工作电极表面，并用牛血清白蛋白及酪蛋白封闭了非特异结合位点；RPA引物，所述RPA引物包括RPA上游引物和RPA下游引物；含RPA组分的冻干粉；醋酸镁；反应缓冲液；亲和素‑HRP酶偶联物；底物溶液以及洗涤液；本发明还公开一种基于所述试剂盒的检测方法。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种RPA扩增联合电化学传感器(RPA-EC)的日本血吸虫检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

血吸虫病是一种危害严重的人兽共患寄生虫病。经过70年的积极防治，当前我国血吸虫病防治工作已进入消除的关键阶段，流行区居民和家畜的血吸虫感染率及感染度均下降至历史极低水平，全国已连续4年未发现镜检血吸虫感染阳性钉螺,上述现状对血吸虫病诊断及监测技术提出了更高的要求。与此同时，我国采用的免疫学及病原学诊断技术的弊端日益明显，不足以满足低流行态势下血吸虫病疫情监测需求，主要表现在：传统的病原学诊断方法对低感染度患者的检测敏感性较低，漏检率高，且费时、费力，群众依从性不高。血清学抗体检测方法敏感性高，操作简便，已广泛应用于对疫区化疗对象的大规模筛查和血清流行病学调查，但易出现假阳性，且抗体水平检测难以区分现症感染和既往感染。

检测血吸虫核酸序列的分子诊断方法因其敏感性高、特异性强等优势，有望为血吸虫病疫情的精准监测提供有效的技术手段。近年来，已有许多日本血吸虫(S.japonicum)核酸检测方法的相关报道，包括PCR、巢式PCR、实时定量PCR、数字PCR、环介导等温扩增重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)等，这些方法大多基于PCR，部分基于等温扩增技术。其中，RPA技术是近年来备受关注且迅速发展的等温扩增技术，25～43℃恒温下5～20min可将核酸扩增至可检测水平,操作简单、快速，且可结合多种方法读取结果，尤其适合基层应用。然而目前报道的基于RPA的日本血吸虫核酸检测方法的敏感性仍不够理想，需探索更加灵敏的检测技术与RPA结合，从而提高核酸检测敏感性及特异性，并通过简化设备及操作，提高检测时效性及重复性，使之更适于现场应用。

发明内容

本发明的目的是联合RPA技术及电化学生物传感技术，提供一种RPA扩增联合电化学传感器(RPA-EC)的日本血吸虫检测试剂盒及其检测方法。

为了实现上述目的，本发明提供一种RPA-EC日本血吸虫检测试剂盒，其包括：多通道传感电极阵列，所述多通道传感电极阵列的每个通道包括工作电极、对电极以及参比电极，所述工作电极表面固定有RPA探针，所述RPA探针为可扩增SjR2基因片段的氨基修饰的RPA探针，所述RPA探针通过与所述工作电极表面的键合作用固定于所述工作电极表面，并用牛血清白蛋白及酪蛋白封闭了所述工作电极表面的非特异结合位点，以避免后续反应中无关DNA及蛋白的非特异吸附；RPA引物，所述RPA引物包括RPA上游引物和RPA下游引物；含RPA组分的冻干粉；醋酸镁，具有启动RPA反应的作用；反应缓冲液，其作用是溶解RPA冻干组分，并在RPA反应中提供稳定的缓冲体系；亲和素-HRP酶偶联物；底物溶液以及洗涤液。

作为一个具体的实例，所述工作电极为碳工作电极，所述碳工作电极表面固定有氨基修饰的RPA探针，所述氨基修饰的RPA探针通过与所述碳工作电极表面的羧基酰胺键合作用固定于所述碳工作电极表面。

作为一个具体的实例，所述工作电极为金工作电极，所述金工作电极表面固定有巯基修饰的RPA探针，所述巯基修饰的RPA探针通过与所述金工作电极金硫键合作用固定于所述金工作电极表面。

作为一个优选的实例，所述多通道传感电极阵列为16通道三电极印刷碳电极阵列。