[发明专利]烟粉虱CREB转录因子及其检测烟粉虱对吡虫啉抗性或敏感性的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体公开烟粉虱CREB转录因子，以及编码基因和重组载体、重组细胞系、重组菌株。进一步地，本发明公开了检测烟粉虱对吡虫啉抗性或敏感性的方法，其针对烟粉虱CREB基因编码的氨基酸序列第111位点的磷酸化水平进行检测，以及所用到的针对烟粉虱CREB的第111位点的特异性磷酸化抗体。通过本发明能够快速的检测烟粉虱对吡虫啉抗性或敏感性，或田间烟粉虱对吡虫啉的抗药性水平。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及烟粉虱CREB转录因子，以及编码基因和重组载体、重组细胞系、重组菌株，以及检测烟粉虱对吡虫啉抗性或敏感性的方法。

背景技术

烟粉虱Bemisia tabaci (Gennadius)是世界性的农业害虫，其危害主要包括直接刺吸植物汁液；传播植物病毒；分泌蜜露导致煤污病等。烟粉虱防治以化学防治为主，由于烟粉虱属于刺吸式小型昆虫，整个发育历期包括卵期，若虫期和成虫期，传统的触杀型杀虫剂如联苯菊酯，阿维菌素等能够很好的杀灭烟粉虱成虫，而无法有效的杀灭处于叶片背面的卵和若虫。新烟碱类杀虫剂如吡虫啉，噻虫嗪等具有良好的植物内吸性，通过喷洒和灌溉农作物，不仅能杀灭烟粉虱成虫，也能高效的杀灭烟粉虱若虫，是刺吸式害虫防治的首选类药物。但是随着杀虫剂的广泛、长期使用，抗药性也逐渐形成，对于抗药性机制的研究是合理使用杀虫剂的重要保障，同时也是农业安全高效生产所不可或缺的重要组成部分。

新烟碱类杀虫剂是一种高效、低毒、环境友好以及选择性强的新型杀虫剂，作用机理是选择性抑制害虫的神经系统重要组成部分烟碱类乙酰胆碱受体（NicotinicAcetylcholine Receptors，nAChRs），与神经递质乙酰胆碱竞争性地结合nAChRs，从而阻断害虫神经传递，造成害虫肌肉细胞出现麻痹而死亡。吡虫啉（Imidacloprid）是第一代新烟碱类化合物，20世纪80年代由拜耳公司开发并推广到全球。2014年全球杀虫剂市场调查显示新烟碱类杀虫剂在全球杀虫剂市场份额中超过25%，其中吡虫啉的使用量达到新烟碱类杀虫剂的33.5%，成为刺吸式害虫防治的全球首选药物。

由于新烟碱类杀虫剂广泛、长期使用，害虫逐渐形成了抗药性，烟粉虱也不例外。例如美国，西班牙等国家通过田间监测发现烟粉虱对第一代新烟碱类杀虫剂吡虫啉产生严重的抗药性。 Luo等在我国首次检测吡虫啉抗性水平，发现北京和新疆等地理种群对吡虫啉比较敏感，而浙江、江苏和湖北地区却产生了中高抗性。随后Wang等在上海地区发现中等抗性的种群，在江苏地区通过田间监测发现一个吡虫啉极高抗性的烟粉虱种群，抗性倍数高达1840，并且该地区噻虫嗪的抗性倍数也高达1470倍，表明该地区已经产生严重的抗药性。申请者于2011年进行田间监测，在北京南口地区发现烟粉虱吡虫啉高抗种群，在纬度更高的地区发现烟粉虱的抗性种群。

害虫对杀虫剂形成抗性的机制主要包括杀虫剂靶标敏感性降低导致的靶标抗性和解毒酶过量表达或酶活增强导致的解毒抗性。靶标不敏感性是害虫对杀虫剂产生高水平抗药性的重要原因。例如田间蚜虫nAChR受体β亚基R81T点突变显著降低其对吡虫啉的结合能力，导致高抗性产生，另外水稻害虫褐飞虱对吡虫啉的抗性形成机制包括nAChR在α1和α3亚基151位置上保守的酪氨酸（Y）突变成丝氨酸（S），降低了褐飞虱nAChR受体与吡虫啉的结合能力，从而为靶标敏感性降低导致的抗性提供了直接的证据。最新研究报道表明nAChR受体α8也与褐飞虱对吡虫啉的抗性相关。

与靶标抗性相比，解毒抗性则更为普遍，特别是中低程度的抗性形成机制。害虫体内存在很多与生理功能和代谢相关的解毒酶，如常见的三大解毒酶系：多功能氧化酶（Cytochrome P450-dependent Monooxygenases, P450），谷胱甘肽转移酶（GlutathioneS-transferases, GST）以及羧酸酯酶（Carboxleseterases, CarE）。害虫在接触杀虫剂后会在体内形成应急反应，通过调动体内的解毒酶系，在一定程度上进行解毒代谢，然后将这些对身体有毒害的物质排除体外。解毒抗性中研究最为广泛的为细胞色素P450解毒代谢机制。