[发明专利]一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物组、荧光可视化快速检测试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物组、荧光可视化快速检测试剂盒及方法。用于检测非洲猪瘟病毒的引物组包括一对特异性外引物，一对特异性内引物和一条环引物，其对应的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.5所示。利用本发明制备的荧光可视化快速检测试剂盒可实现对非洲猪瘟病毒的高灵敏度和高特异性检测，同时操作简便，仅需能恒温扩增的水浴或恒温扩增仪器即可进行检测，成本较低，设备适用范围广，适于在疫病发生时现场快速诊断疫病，及时治疗。

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物组荧光、可视化快速试剂盒及方法。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高接触性传染病，又称非洲猪瘟 疫或疣猪病。临床以高热、食欲废绝、皮肤和内脏器官出血、高死亡率为特 征。非洲猪瘟病毒属于非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属，也是非洲猪瘟病 毒科的唯一成员。该病毒粒子二十面体对称，呈同心圆状结构。ASFV不同 毒株间基因组大小不同，在170-193kb之间，共编码约150-167个蛋白，包括 病毒复制所需蛋白，此外许多基因与病毒的复制无关，但卷入了抑制和逃逸宿主防御系统。因此在临床上需要一种能够快速检测或筛查ASFV毒株的检 测方法。

传统的ASFV检测方法主要是血清学检测(酶联免疫吸附试验ELISA、间接免疫过氧化物酶反应检测、间接免疫荧光和免疫印迹法等)和病原学检测(PCR、荧光PCR和胶体金试纸条等)。目前最常用检测方法为荧光定量 PCR，该检测方法灵敏度和特异性较好，但存在需要专业的检测实验室，高成本仪器设备，试验所需时间较长，对操作人员的分子生物学技术背景要求很高，试剂成本贵，难以在基层实际生产中普及应用。目前，用于非洲猪瘟病毒的荧光PCR方法需要专业的实验室、技术人员和设备，易导致检测结果滞后，不适用于现场快速检测。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，能在等温(60-65℃)条件下，短时间(通常是一小时内)内进行大量的核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。与常规PCR相比，该方法不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，具有简单、快速、特异性强的特点；在灵敏度、特异性和检测范围等指标上也能媲美甚至优于PCR技术，且该方法不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场快速检测，但目前由于内、外引物和环引物的设计难度较大，一般较难达到理想的检测效果。

发明内容

本发明的一个目的是提供一组用于检测非洲猪瘟病毒的特异性引物组，该引物组适用于环介导等温扩增进行检测。本发明的另一目的是提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、荧光可视化的LAMP试剂盒，用于非洲猪瘟病毒的现场、快速、精确地检测。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一组用于检测非洲猪瘟病毒的特异性引物组，包括一对特异性外引物，一对特异性内引物和一条环引物，其中，特异性外引物的核苷酸序列分别为如SEQ ID NO.1所示的F3和如SEQ ID NO.2所示的B3，所述特异性内引物的核苷酸序列分别为如SEQ ID NO.3所示的FIP和如SEQ ID NO.4所示的 BIP，所述环引物的核苷酸序列为如SEQ ID NO.5所示。

第二方面，本发明提供了非洲猪瘟病毒的特异性引物组合在制备检测试剂中的应用，所述检测试剂优选为试剂盒，所述试剂盒优选为LAMP试剂盒，本发明的试剂盒适用于水浴锅、PCR仪、恒温金属浴、恒温扩增仪等一系列恒温扩增设备。

如上所述的引物组在制备检测非洲猪瘟病毒的LAMP试剂盒中的应用。