[发明专利]一种猪粪便污染的微生物溯源方法

说明书

本发明公开了一种猪粪便污染的微生物溯源方法，涉及微生物溯源技术领域。包括正向引物PF163F和反向引物Bac708R，还提供了基于上述引物组的试剂盒和检测方法。本发明利用一对特异性、敏感性和准确性都为100％的猪源特异性拟杆菌PCR引物，可用于在中国环境水体中检测猪源粪便污染。

技术领域

本发明涉及微生物溯源技术领域，具体涉及一种猪粪便污染的微生物溯源方法。

背景技术

地表水体的粪便污染是畜禽养殖业导致的主要环境污染问题之一。在中国养殖业中，养猪业产生的粪污不仅数量占比最多，而且由于较难处理而常常出现漏排偷排的现象，从而导致了环境水体的粪便污染。准确鉴别猪源粪便污染有助于环境管理部门从源头上彻底治理猪源粪便污染。

微生物溯源(Microbial source tracking，MST)技术为追踪猪源粪便污染源提供了有效手段，其主要是依据源指示微生物与宿主之间所具有的特异性关系进而来定位污染源。

然而，目前为止，中国缺乏在地表水体中猪源粪便污染微生物溯源的相关技术及方法流程。虽然PCR法检测可用于地表水环境的猪源粪便污染溯源分析。但是，由于人、猪、鸡或羊等体内均有拟杆菌，并且不同地区的猪肠道拟杆菌基因存在差异，导致猪源粪便污染微生物溯源检测被干扰，产生假阳性或假阴性检测结果。

因此，本发明提供一种猪粪便污染的微生物溯源方法，普遍适用于我国地表水体样本检测，提高特异性、敏感性和准确性是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种猪粪便污染的微生物溯源方法。经过评估、优化反应条件以及验证，最终获得一对特异性、敏感性和准确性都为100％的猪源特异性拟杆菌PCR引物，可用于在中国环境水体中检测猪源粪便污染。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种猪粪便污染的微生物溯源引物，包括正向引物PF163F和反向引物Bac708R，引物序列为：

正向引物PF163F：5’-GCGGATTAATACCGTATGA-3’，SEQ ID NO:1所示；

反向引物Bac708R：5’-CAATCGGAGTTCTTCGTG-3’，SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了一种基于上述引物组的试剂盒，包括正、反向引物和反应液。

优选的：正、反向引物：25μmol/L正向引物PF163F；25μmol/L反向引物Bac708R；所述反应液包括10×Ex Taq buffer、dNTP Mixture、5U/μL TaKaRa Ex Taq、5mg/mLBSA。

本发明还提供了一种猪粪便污染的微生物溯源方法，PCR反应体系：5μL的10×ExTaqbuffer、4μL的2.5mM dNTP Mixture、0.25μL 5U/μL TaKaRa Ex Taq、1μL 5mg/mL BSA、1μL 25μmol/L正向和1μL 25μmol/L反向引物、1μL模板DNA，最后用无菌超纯水补至25μL。

优选的：PCR反应条件为：95℃3min，30个循环：95℃30s，62℃1min，72℃30s，最后72℃10min。

本发明还提供了一种基于上述引物或上述试剂盒在中国环境水体监测中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种猪粪便污染的微生物溯源方法，取的技术效果为克服了国内不同地区的猪肠道拟杆菌基因差异对检测的影响，并排除人、牛、鸡、羊等体内拟杆菌的干扰，采用本发明提供的方法，对猪粪便污染的微生物检测的特异性、敏感性和准确性都为100％。

附图说明