[发明专利]一种采用Ala-Gln调控抗体半乳糖基化水平的方法

说明书

本发明提供了一种采用Ala‑Gln调控抗体半乳糖基化水平的方法。通过向表达蛋白的细胞的培养过程中添加Ala‑Gln调节半乳糖修饰比例，同时保证了蛋白产量，解决了常用的降温方法降低抗体半乳糖修饰比例同时也会降低细胞培养蛋白产量的问题。本发明提供的方法操作简单，程序可控，适于量化生产。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种采用Ala-Gln调控抗体半乳糖基化水平的方法。

背景技术

蛋白质的糖基化是一种最常见的蛋白翻译后修饰，是在糖基转移酶作用下将糖类分子转移至蛋白质特定位置。蛋白质上糖链的结构和组成会显著影响蛋白的稳定性、安全性和有效性。因此，理解蛋白糖型的功效和控制糖型合成十分重要。

哺乳动物中蛋白质的糖基化类型可分为3种：N-糖基化、O-糖基化和GPI糖基磷脂酰肌醇锚。N-连接的糖链合成起始于内质网，完成于高尔基体。N-糖链合成的第一步是将一个14糖的核心寡聚糖添加到新形成多肽链的特征序列ASN-X-SER/THR(X代表任何一种氨基酸)的天冬酰胺上，天冬酰胺作为糖链受体。核心寡聚糖由2分子N-乙酰葡萄糖胺、9分子甘露糖和3分子葡萄糖依次组成，第一位N-乙酰葡萄糖胺与ER双脂层膜上的磷酸多萜醇的磷酸基结合，当ER膜上有新多肽合成时，整个糖链一起转移。寡聚糖转移到新生肽以后，在ER中进一步加工，依次切除3分子葡萄糖和1分子甘露糖。在内质网形成的糖蛋白具有相似的糖链，由Cis面进入高尔基体后，在各膜囊之间的转运过程中，发生了一系列有序的加工和修饰，原来糖链中的大部分甘露糖被切除，但又被多种糖基转移酶依次加上了不同类型的糖分子，形成了结构各异的寡糖链。

单克隆抗体作为一种糖蛋白是非常重要的治疗药物。单克隆抗体在体内的生理活性受2种独立的机制调节：靶向抗原并中和或者引发细胞凋亡以及抗体Fc效应功能，其中抗体Fc效应功能包括抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒作用(CDC)。研究发现，抗体的Fc端效应功能与位于该区域的寡糖链有关。提高IgG抗体半乳糖修饰比例会显著增强CDC效应。并且，半乳糖增加可能会提高抗体唾液酸化水平，唾液酸化水平增强可以提高糖蛋白血清中的半衰期；但是，半乳糖增加也会降低ADCC效应，因此，降低抗体半乳糖可能能防止ADCC效应降低。因此，需要采用合适的细胞培养方法调控抗体半乳糖基化水平至合适的水平。

单克隆抗体的糖基化可以影响蛋白药物的药效动力学和药代动力学，从而增强药物治疗效果。单克隆抗体IgG的N-糖基化位点一般位于Fc端CH2结构域上的ASN-297残基上。目前，大部分抗体药物由中国仓鼠卵巢细胞CHO表达，采用该表达系统生产的抗体蛋白抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质最接近，糖基化等翻译后修饰最准确。但是，采用该表达系统生产的抗体糖型受到细胞培养方法影响展现出多样性，从而可能影响抗体蛋白FC效应功能。

在生物类似药开发过程中，抗体质量要求与原研药可比，糖型属于抗体的关键质量属性，需要将所开发的生物类似药糖型调控至与原研药可比。目前，通过细胞培养获得的抗体蛋白半乳糖修饰比例高于原研药，细胞培养方法对抗体糖型调控有显著影响。细胞培养的细胞株、工艺参数以及培养基成分均影响单克隆抗体的糖基化。有研究采用基因工程策略改变糖型合成过程中涉及的糖基转移酶基因，也有研究对表达的蛋白在体外进行修饰。细胞培养工艺参数pH、温度、pCO₂会影响抗体糖型。其中，采用降温方法来降低半乳糖修饰比例是比较常用的方法。但是采用降温方法降低抗体半乳糖修饰比例同时也会降低细胞培养蛋白产量。

Ala-Gln主要用于细胞培养，具有提高细胞培养密度、细胞活率和表达量的作用，Ala-Gln调节抗体半乳糖修饰比例的方法尚未见报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明通过优化Ala-Gln添加浓度，达到调控半乳糖修饰比例的目的，同时保证了抗体表达量。

术语：本发明中糖指的是单糖或者多糖。

本发明中描述的糖蛋白指的是具有糖链的蛋白或者多肽，因此，凡是蛋白质或多肽上连接有糖链的均定义为糖蛋白。